普罗布考对动脉粥样硬化兔主动脉白三烯C4的影响
2014-04-04吴乐黎红华武强刘子建
吴乐,黎红华,武强,刘子建
普罗布考对动脉粥样硬化兔主动脉白三烯C4的影响
吴乐1,黎红华1,武强1,刘子建2
目的:观察普罗布考对高同型半胱氨酸(Hcy)血症诱导动脉粥样硬化(AS)兔主动脉白三烯C(4LTC4)的影响。方法:将24只雄性新西兰大耳白兔随机分成3组各8只:对照组给予基础饲料喂养;模型组和普罗布考组在基础饲料中加入1%的蛋氨酸;普罗布考组从第12周起用普罗布考(1 g/d)灌胃;饮食量200 g/d,均喂养20周。第20周末用RT-PCR检测动脉血管中白三烯C4合成酶(LTC4S)的mRNA表达,用ELISA检测动脉血管中LTC4的含量。结果:模型组腹主动脉LTC4S的mRNA表达及LTC4的含量较对照组增高(< 0.05),普罗布考组腹主动脉LTC4S的mRNA表达水平及LTC4含量低于模型组(<0.05)。结论:普罗布考能抑制主动脉LTC4S的mRNA表达,降低主动脉LTC4的含量,该作用可能为其抗AS的机制之一。
普罗布考;同型半胱氨酸;动脉粥样硬化;白三烯C4;白三烯C4合成酶
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发病机制相当复杂,目前认为炎症反应是AS的一个关键性致病机制。白三烯(leukotrienes,LTs)是花生四烯酸经5-脂氧酶代谢的促炎症介质,最近的研究显示LTs在AS的发生发展过程中起重要作用。白三烯C4(leukotriene C4,LTC4)是一种重要的LTs,LTC4合成酶(leukotriene C4synthase,LTC4S)是合成LTC4的关键酶。笔者在以往的研究中观察到给予高蛋氨酸饮食导致兔高同型半胱氨酸(homocysterine,Hcy)血症,并诱导兔主动脉粥样硬化,普罗布考能减轻兔主动脉内膜增生程度,但相关机制仍需进一步探讨[1]。本研究以高蛋氨酸饮食诱导兔高Hcy血症及AS模型,观察普罗布考对高Hcy诱导AS兔主动脉LTC4的影响,探讨普罗布考抗AS的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 雄性纯种新西兰大耳白兔24只,体质量2.0~2.5 kg,购自湖北省动物实验中心。
1.1.2 主要试剂 普罗布考粉剂购自山东齐鲁制药有限公司。LTC4S引物由大连宝生物工程有限公司设计并合成。兔LTC4ELISA试剂盒购自武汉俊泰生物科技有限公司(美国R&D公司生产,中国分装)。
1.2 方法
1.2.1 实验分组及给药 动物随机分为对照组、模型组和普罗布考组3组各8只:对照组给予基础饲料200 g/d,模型组和普罗布考组给予高蛋氨酸饲料200 g/d(基础饲料中加入1%蛋氨酸),普罗布考组从第12周开始给予普罗布考1 g/d灌胃,均喂养20周。
1.2.2 RT-PCR检测腹主动脉中LTC4S的mRNA表达水平 按照Trizol说明书方法提取组织总RNA,测定总RNA浓度及纯度。RT-PCR反应:在25 μL逆转录反应体系中,以4 μg总RNA为模板,用Mix逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA。引物序列:LTC4S:5'-CCA GGT AAA TGC AGC GAG TA-3'(上游),5'-TGT GCC AGG GAG GAA GTG-3'(下游),扩增片段为247 bp;GAPDH:5'-GGA AAT CGT GCG TGA CAT T-3'(上游),5'-TAG GAG CCA GGG CAG TAA TC-3'(下游),扩增片段为350 bp。反应参数:95℃预变性5 min,94℃变性30 s,57℃退火 45 s,72℃延伸30 s×33个循环,72℃终末延伸5 min。扩增产物以1.6%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统进行半定量分析。每个实验组重复6次。
1.2.3 ELISA检测腹主动脉中LTC4的水平 制备腹主动脉匀浆,按照试剂盒说明书进行,应用酶标仪,在450 nm下读取吸光度(optical density,OD)值,以标准品浓度由低到高自左至右为横坐标(X)轴,450 nm下读取的各检测孔OD值为纵坐标(Y)轴。在Logit-Log直线回归计算模式下绘制出标准曲线图,在标准曲线图上根据每个待测样本的OD值查找出其相对应的浓度。
1.3 统计学处理
采用SPSS17.0软件分析数据,正态性检验,正态分布的结果以(均数±标准差)(±s)表示,单因素方差分析,组间的两两比较采用Student-Newman-Keuls检验,<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 腹主动脉LTC4S的mRNA表达比较
模型组和对照组腹主动脉LTC4S的mRNA表达分别为 (0.127±0.010)、(0.059±0.005),前者水平较后者增高(<0.05);普罗布考组腹主动脉LTC4S的mRNA表达为(0.061±0.006),与模型组相比明显降低,差异有统计学意义(< 0.05),见图1。
2.2 腹主动脉LTC4的水平变化
ELISA结果提示,对照组、模型组和普罗布考组的腹主动脉LTC4水平分别为(32.3±5.7)ng/mL、(52.6±8.6)ng/mL、(35.8±6.1)ng/mL,模型组的腹主动脉LTC4水平较对照组明显增高(<0.05);普罗布考组腹主动脉LTC4的水平降低,与模型组相比差异有统计学意义(< 0.05),见图2。
3 讨论
LTs是花生四烯酸经5-脂氧酶代谢的促炎症介质。花生四烯酸被5-脂氧酶代谢为不稳定的中间产物白三烯A4(leukotriene A4,LTA4),在LTA4水解酶的作用下,LTA4转换成为白三烯 B4(leukotriene B4,LTB4),或在LTC4S的作用下,LTA4与谷胱甘肽结合,生成LTC4。释放到细胞外微环境的LTC4,经过连续的氨基酸裂解,产生白三烯D4(leukotriene D4,LTD4) 和 白 三 烯 E4(leukotriene E4,LTE4)[2]。因此,LTC4S是LTA4和谷胱甘肽转化为LTC4、LTD4和LTE4过程中的重要酶。LTC4、LTD4和LTE4统称为半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes,cys-LTs),cys-LTs与其受体结合发挥生物学效应,cys-LTs受体包括cys-LT1和cys-LT2受体。最近的研究表明LTs与AS之间存在密切的关系。Bäck等[3]对人冠状动脉平滑肌细胞进行体外培养,发现加入LTB4后能促进人冠状动脉平滑肌细胞的迁移和增殖,提示LTB4在血管内膜增生以及AS中的作用。Allen等[4]将LTC4和LTD4分别作用AS患者及非AS患者的冠状动脉,结果显示LTC4和LTD4能明显诱导AS患者的冠状动脉收缩,而非AS患者的冠状动脉对LTC4和LTD4无反应,结合冠心病患者血清的LTs水平升高,作者认为LTs参与AS的发病机制。人AS的好发部位主动脉、颈动脉和冠状动脉中均可检测到LTC4S、cys-LT1和cys-LT2受体[5]。Cys-LTs可通过与cys-LT2受体结合,强烈激活内皮细胞上AS相关的即刻早基因[6]。Cys-LTs在血管平滑肌的增殖和迁移中也起重要作用,血管内膜受损后,新生内膜形成,免疫组化结果表明cys-LT1和cys-LT2受体在损伤动脉壁上均有表达。LTC4、LTD4和LTE4刺激平滑肌细胞的迁移,该效应可被cys-LT受体拮抗剂孟鲁司特抑制[7]。总之,以上研究提示LTs与AS的形成及发展密切相关。
普罗布考是FDA唯一认证的抗氧化药物,最初以降脂药应用于临床,近年发现其具有抗氧化的作用,如改善血管内皮功能、抑制平滑肌细胞增殖等。动物实验及临床研究均显示普罗布考具有抗AS作用[8,9]。普罗布考分子内所含的酚羟基很容易被氧化而发生断链,捕捉氧离子并与之结合形成稳定的酚氧基,有效降低氧自由基浓度,从而预防或延迟AS的发生和发展,可通过其较强的抗氧化作用抑制炎症的发展[10]。而且,普罗布考为脂溶性分子,易于穿过内皮细胞到达血管壁及脂质斑块之间发生抗氧化作用,从而有效抑制斑块的形成,发挥强大的抗AS作用。
本研究观察到模型组兔主动脉LTC4S的mRNA表达及LTC4含量较对照组明显增高,进一步证实LTC4S及LTC4与AS之间存在密切的关系。同时,普罗布考能显著降低兔主动脉LTC4S的mRNA表达水平及LTC4的含量,提示该作用可能是普罗布考抗AS的机制之一。
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(本文编辑:王晶)
Effect of Probucol on Leukotriene C4in Aorta of Atherosclerotic Rabbits
Objective:To investigate the effect of Probucol on the expression of leukotriene C4(LTC4)in the aorta of atherosclerotic rabbits induced by hyperhomocysteinemia.Methods:Twenty-four male rabbits were randomly divided into three groups.The control group was fed on common food,the model group was fed on high-methionine food containing 1%methionine,and the Probucol group received high-methionine food and Probucol 1 g/d perfused into stomach from the 12th week.The food was 200g/d for 20 weeks.The aorta was removed to investigate the leukotriene C4synthase(LTC4S)mRNA expression by RT-PCR and the protein level of LTC4by ELISA at 20th week.Results:Compared with those in the control group,the mRNA expression of LTC4S and the level of LTC4were increased in the model group (<0.05).And compared with those in the model group,the mRNA expression of LTC4S and the level of LTC4were down-regulated in the Probucol group(<0.05).Conclusion:Probucol could reverse the aortic lesion induced by hyperhomocysteinemia which may be mediated by the suppressive effect on LTC4S mRNA expression and the level of LTC4.
Probucol;homocysterine;atherosclerosis;leukotriene C4;leukotriene C4synthase
R741;R741.05
A DOI 10.3870/sjsscj.2014.05.006
1.广州军区武汉总医院神经内科武汉430070;2.华中科技大学同济医学院解剖学系武汉430030
2013-12-04
黎红华whzyylhh@163.com