转录因子 Cdx1在大鼠胚胎肛门直肠发育过程中的时空表达

张涛 张胜逆 李靖华 杨季红 商琰红 王晓春 李鹏 游冀鹏 张爱民 程树杰

肛门直肠畸形(ARM)是常见的小儿消化道畸形之一，严重影响患儿的生活质量［1－3］。ARM的预防和治疗的关键在于明确该畸形的基因调控和胚胎发生机制，普遍研究认为ARM是一组受多因素影响的，涉及多个基因的复杂畸形。最近国外学者在大鼠胚胎发育研究中发现Cdx1在哺乳动物尾端发育中起到了重要的作用，尤其是对于后肠的发育特别关键［4］。采用人类全基因组表达谱芯片技术对比分析正常和ARM患者直肠末端组织基因表达谱系的变化，结果显示有多个涉及Cdx1在高位ARM与正常人直肠末端组织中呈现差异表达［5］。据此我们推断Cdx1可能在泄殖腔和直肠的发育中起重要作用，与ARM的发生相关。而在胚胎期肛门直肠发育中Cdx1的时空分布模式仍不明确，Cdx1在ARM的发生过程中如何发挥的作用仍未得到满意的解释。因此，本研究应用乙烯硫脲(ethylenethiourea，ETU)致畸的Wistar大鼠的ARM 动物模型，分析Cdx1蛋白和mRNA在正常及ARM大鼠胚胎肛门直肠的时空分布规律，探讨Cdx1在大鼠胚胎肛门直肠发育过程中所发挥的作用;研究Cdx1/Tcf4与ARM胚胎发生机制的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 动物:体重250～300 g的Wistar大白鼠(购自中国医科大学动物实验中心并饲养，CMU-WR-102)，雌雄午夜合笼后次晨雌鼠阴道涂片，显微镜下见到精子即确认已交配，此日计妊娠第0天。ETU组:24只大鼠于妊娠第10天经胃管注入125 mg/kg的ETU。正常组:12只大鼠于妊娠第10天经胃管注入等量的0.9%氯化钠溶液。2组孕鼠分别做以下处理:分别于妊娠第13～16天，18天，21天正常组各取2只，ETU组各取4只孕鼠行剖宫术，取出所有胎鼠。将30%第16天之前的整个胚胎和第16天以后的胚胎躯干的尾部置入4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定，常规脱水，石蜡包埋，进行矢状面连续切片，厚4 μm。余下胎鼠置于液氮15～20 min后转移至－80℃冰箱保存，以备显微切割提取组织蛋白和mRNA。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色:胎鼠正中矢状面连续切片，Cdx1免疫组化染色。连续动态对比观察Cdx1在正常和畸形大鼠胚胎泄殖腔及肛门直肠发育过程中的表达。免疫组化染色具体步骤:一抗为1∶200山羊抗大鼠Cdx1抗体(Santa Cruz公司，美国)，4℃孵育12 h。二抗采用福州迈新公司S-P试剂盒，DAB显色经苏木素复染，脱水、透明后封片。Cdx1免疫组织化学染色见胞核呈棕黄色为阳性，该细胞为阳性细胞。每次染色均设阴性和阳性对照。采用 NIS－Elements Basic Research多媒体彩色病理图像分析系统对 Cdxl表达进行定位观察分析，每张切片分别观察100倍、200倍及400倍视野图像，来判定阳性细胞的分布区域及大体变化趋势。

1.2.2 Western-blot检测组织中的蛋白质表达量:①常规制备三组胎鼠冰冻切片，解剖显微镜下手工显微切割方法准确切取泄殖腔标本。组织总蛋白提取:组织经破碎，组织匀浆低温离心，应用南京凯基全蛋白提取试剂盒提取总蛋白。其含量按改良Lowry法测定，于－20℃冻存备测。②Western blot杂交:取总蛋白40 μl，经6%SDS－PAGE电泳后转移至硝酸纤维膜(Invitrogen公司)上，5%牛血清白蛋白封闭抗原后，加入山羊抗大鼠Cdx1抗体(1∶200稀释)和β-actin抗体(1∶5 000 稀释，Sigma公司)，4℃孵育12 h。洗膜后，加碱性磷酸酶标记的兔抗山羊IgG(工作浓度1∶2 000，Santa Cruz公司)进行二抗杂交、显色。结果采用GIS－2020凝胶图象分析系统扫描分析结果，对蛋白质含量进行密度分析，以相对灰度值代表蛋白表达量。

1.2.3 RT-PCR方法:常规制备2组胎鼠冰冻切片，解剖显微镜下手工显微切割方法准确切取泄殖腔标本。RT-PCR方法具体步骤:Trizol提取组织总RNA，计算RNA纯度。逆转录合成 cDNA反应体积为20 μl，具体步骤参照逆转录试剂盒(TaKaRa公司)推荐方法。利用Primer5.0版软件设计引物(上海 Invitrogen生物技术有限公司):F-5’-TGTGGTGAGCCTGTTGGA-3’;R-5’-CCCTCTGAATCTTGGGAAAT-3’(116bp)，扩增片断长度116bp。内参照选用β-actin，扩增片断长度690 bp。PCR扩增反应总体积为25 μl。反应条件:95℃预变性 2 min，94℃ 40 s，52.4℃ 40 s，72℃ 40 s，35个循环，72℃延伸 7 min。PCR 产物于3%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，紫外灯下观察，以Marker DL2000为分子量标准。用G:BOX SYNGENE凝胶分析系统分析扩增产物。

1.3 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察结果 正常组共产胎仔186只，未见畸形发生。ETU组共产胎仔212只，均为无尾或短尾，根据切片观察后分为给药无畸形组(n=65)和畸形组(n=139)。ARM在 ETU组中的发生率为65.7%(139/204)。胎龄第16～21天胎鼠中的无肛畸形均为直肠尿道瘘和泄殖腔畸形。

2.2 免疫组化结果

2.2.1 正常组:第13天时，大量的Cdx1阳性细胞分布于尿直肠隔、后肠和泄殖腔膜的上皮层，在泄殖腔膜的外层细胞内也可见一定量的阳性细胞分布(图1A、a)。第13.5天时，阳性细胞集中分布于背侧尿直肠隔和后肠的上皮。第14天时，阳性细胞主要出现在尿直肠隔与泄殖腔膜的接近融合区域，同时，直肠肛管末端与尾沟的组织内也可见大量的阳性细胞。并且，免疫反应的强度几乎达到顶峰(图2 A、a)。第15天，大量的阳性细胞聚集于尿直肠隔与泄殖腔膜的融合区域的上皮;免疫反应强的阳性细胞在菲薄的肛膜上也出现。第16天，肛膜破裂，肛门直肠与外界相通，Cdx1在直肠黏膜层表达。

2.2.2 肛门直肠畸形组:第13天，Cdx1表达于尿直肠隔和后肠上皮中，强度较弱，在泄殖腔膜上皮仅在外层细胞中见到零星的阳性细胞分布(图1B、b)。第13.5天，极少量的阳性细胞在泄殖腔膜、尿直肠隔顶端以及后肠上皮。第14天，阳性细胞散在分布在瘘管和后肠的上皮中(图2 B、b)。第15天，直肠尿道瘘清晰可见，Cdx1在瘘管和后肠上皮中表达极弱。第16天，阳性细胞散在出现在瘘管和直肠肛管上皮中。与正常组相比，给药无畸形组在各胎龄均差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 Western-blot检测Cdx1的表达 Western蛋白印迹结果显示，与正常组相比较，Cdx1的表达在ARM组中表现出相对的时间不均衡性。在肛门形成的关键时期即第14天、14.5天和15天，于正常组Cdx1的表达量达到顶峰而在ARM组表达量明显下降(156.9±23.5 vs.102.7 ± 14.4(第 14 天)，165.5 ± 26.2 vs.104.5 ±14.6(第 14.5 天)，153.6 ± 19.4 vs.76.2 ±10.7(第15天)(P＜0.05);自第16天起，在正常组和ARM组均可见Cdx1的表达开始减弱。见表1。

表1 Cdx1蛋白的相对表达量在正常组及ARM组的比较情况±s

表1 Cdx1蛋白的相对表达量在正常组及ARM组的比较情况±s

组别13 d 13.5 d 14 d 14.5 d 15 d 16 d正常组 72.5 ±10.8 134.9 ±20.3 156.9 ±23.5 165.5 ±26.2153.6 ±19.4 105.3 ±10.4 ARM 组 56.3 ±7.8 72.5 ±10.1 102.7 ±14.4 104.5 ±14.6 76.2 ±10.7 69.5 ±7.8 P组0.032 0.018 0.017 0.024 0.032 0.019

2.4 RT-PCR结果 在正常组和畸形组大鼠胚胎中均能检测出Cdx1 mRNA表达。在正常组胎龄第14～15天为表达高峰期。畸形组与正常组相比较，Cdx1 mRNA的表达在第13～16天明显降低［0.52±0.08 vs.0.38 ± 0.04(第 14 天)，0.49 ± 0.06 vs.0.37 ±0.08(第15 天)］，差异有统计学意义(P＜0.05)。肛门与外界相通后，即从GD16后Cdx1 mRNA表达量逐渐降低，正常组和ARM组在胎龄第18天和20天比较无明显差异(P＞0.05)。见表2。

表2 Cdx1 mRNA的相对表达量在正常组及ARM组的比较±s

表2 Cdx1 mRNA的相对表达量在正常组及ARM组的比较±s

组别13 d 13.5 d 14 d 14.5 d 15 d 16 d正常组 0.27 ±0.03 0.36 ±0.03 0.52 ±0.08 0.49 ±0.06 0.47 ±0.05 0.36 ±0.04 ARM 组 0.18 ±0.01 0.27 ±0.06 0.38 ±0.04 0.37 ±0.08 0.36 ±0.03 0.26 ±0.07 P值0.023 0.021 0.016 0.022 0.047 0.035

图1 Cdx1在第13天正常组和ARM大鼠胚胎泄殖腔的表达(A、B×100;a、b ×400)A、a为正常组、B、b为 ARM组 H:后肠;URS:尿直肠隔;U:尿生殖窦;CL:泄殖腔;CM:泄殖腔膜;TG:尾肠;橙色箭头:阳性细胞

图2 Cdx1在14d正常组和ARM大鼠胚胎泄殖腔的表达(A＆B×100;a＆b×400)A＆a为正常组，B＆b为ARM组H:后肠;URS:尿直肠隔;U:尿道;CL:泄殖腔;CM:泄殖腔膜;F:瘘管

3 讨论

ARM的预防和治疗的关键在于明确该畸形的基因调控和胚胎发生机制。普遍研究认为，ARM的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果。流行病学和动物实验表明遗传因素在其发病过程中发挥重要作用［6］，ARM是一组受多因素影响的，涉及多个基因的复杂畸形。目前国内外对该畸形的实验研究多采用动物模型，应用ETU、维甲酸等致畸大鼠产生ARM，观察其胚胎发生的病理改变和基因表达规律及模式。最近有学者在应用基因敲除制备ARM小鼠模型中发现Shh 信号通路［7－9］、Fgf10［8］、Bmp4［9］、EphB2［10］可能参与了ARM的发，但在错综复杂的调控网络中，上述基因又不同程度的与Cdx1通过不同信号分子间的通路存在相互作用，触发了调节细胞生长、迁移、分化及发育等多方面的复杂信号级联反应。

在消化道形成过程中，众多基因参与其中，其中大多数基因在发育过程中具有高度保守-同源盒基因［11］。同源异型框基因及相关蛋白以核转录调节因子的形式调节生物结构及细胞分化，在生物体的不断演化过程中，决定着生物体正常结构并始终保持相对的保守性。Cdx1为果蝇同源异型盒基因(homeobox gene)的同源体，编码转录因子，可控制胚胎细胞的发育和分化［12］。在小鼠胚胎的研究中发现，至 GD8.5，Cdx1 mRNA最初表达于发育中肠管的内胚层细胞中［13］，该基因大部分表达限定在消化道上皮，起始于十二指肠，遍布于小肠和大肠，可提供上皮细胞沿消化道前后轴的位置信息，且在直肠区域表达至最高峰［14］;对消化道上皮细胞的增殖与分化起调控作用。上述结果提示在胚胎肛门直肠发育过程中，Cdx1发挥了重要的作用。

在本研究中，我们采用免疫组化染色、Western blot和RT-PCR技术分析Cdx1在正常和畸形大鼠胚胎发育中的时空表达模式。本研究中显示，在正常组，Cdx1的表达有着严格的时间依赖性规律，在GD14、GD14.5和 GD15，Cdx1的表达处于最高水平，一旦肛门形成与外界相通，其表达水平即开始逐步下降;然而在畸形组中Cdx1的表达水平较正常组明显减低且缺乏动态变化。Cdx1在蛋白水平和mRNA水平统计分析，发现在肛门形成的关键时期，即胎龄第14天、14.5天和第15天时在正常组二者的表达达到最高水平，然而在同时期的ARM组表达显著的降低，这不仅说明Cdx1在正常的肛门直肠发育中发挥重要作用，在ARM的形成过程中可能也起到了关键的作用。综上，我们认为，胎龄第14天、14.5和15天是Cdx1在胚胎泄殖腔发育中的最佳转录时间，而在此关键时期特异性的Cdx1表达下调会干扰肛门直肠的正常发育，影响靶基因在此区域的转录和翻译，可能使尿直肠隔尾端细胞增殖和迁移受阻，尿直肠隔和泄殖腔膜的融合障碍，产生ARM。因此我们推测，在肛门直肠的发育过程中，Cdx1不仅对正常的发育有调控作用，并且胚胎时期的Cdx1表达水平的减低可能与ARM的发生相关。

本研究通过免疫组织化学方法发现正常胎鼠和ETU致ARM胎鼠泄殖腔和直肠Cdx1的表达呈现出空间依赖性的特点:在正常组，Cdx1主要集中表达于尿直肠隔尖端上皮、后肠背侧、泄殖腔膜融合区等和尿直肠隔与泄殖腔融合作用相关的区域。GD16时肛膜破裂，肛门直肠形成，Cdx1在直肠黏膜层表达。而在畸形组中，在上述区域中仅有零星的阳性细胞出现。据此我们推测肛门直肠发育过程中的形态的变化是依赖Cdx1精准的空间定位表达的。Cdx1在ARM胎鼠泄殖腔和直肠黏膜亦有表达，但表达强度较正常组明显减低，从而影响了泄殖腔/后肠区域在特定时间内的细胞增殖、转化和细胞凋亡，会干扰肛门直肠的正常发育，影响靶基因在此区域的转录和翻译，可能使尿直肠隔尾端细胞增殖和迁移受阻，尿直肠隔和泄殖腔膜的融合障碍，产生ARM。

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