托吡酯致小鼠胚胎毒性及叶酸干预的实验研究

郑丽娜 李云霞 阚淑娟 王春艳

癫痫是一组由大脑神经元突然异常放电所引起的短暂大脑功能失调的慢性综合征，具有突然、反复发作的特点［1］。癫痫是妊娠期女性需要持续治疗的最常见神经系统疾病［2］。癫痫女性妊娠期间的病情往往比未妊娠期加重，死胎或新生儿死亡的发生率升高，早产儿和畸形儿的发生率增加，孕产妇的死亡更加常见［3－5］。我国每年有(3～4)/万的新生儿来自患有癫痫疾病的母亲，癫痫孕妇后代畸形发生率高于正常女性的2～3倍［1］。抗癫痫药物(AEDs)是目前治疗癫痫最常用和最重要的手段，其安全性越来越受到广泛的关注。有研究表明，所有的AEDs均具有不同程度的致畸作用［6］。新一代抗癫痫药托吡酯(TPM)以其多重的药理作用在临床实践中表现出明显的治疗效果［7］，但其对胚胎的发育是否有毒性作用无相关报道。本实验以小鼠为研究对象，观察TPM的胚胎毒性作用及叶酸(folic acid，FA)的干预效应，从而为临床上服用TPM的生育期女性安全用药提供动物实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级昆明种小鼠，由北京华阜康生物科技股份有限公司实验动物中心提供。合格证号:SCXK(京)2009-0004。雌性体重(21.8 ±1.7)g，雄性体重(22.6 ±1.8)g，自然光照，自由饮水进食，适应性饲养七天。TPM(西安杨森制药有限公司，25 mg/片，批号:090724035)，FA(北京北大药业有限公司，每片0.4 mg，批号:S090528);两种药物用蒸馏水配制成所需浓度。

1.2 动物分组及给药 按雌雄比例2∶1合笼交配，次日清晨定时检查雌鼠阴栓，以查见阴栓者为妊娠零天，并随机分为5组，每组20只孕鼠。分别为:(1)空白对照组:每天灌胃蒸馏水，容量为10 ml·kg－1·d－1;(2)TPM 低剂量组:40 mg·kg－1·d－1经口灌胃;(3)TPM 高剂量组:80 mg·kg－1·d－1经口灌胃;(4)TPM低剂量 +FA 组:TPM40 mg·kg－1·d－1经口灌胃，同时添加 0.7 mg·kg－1·d－1FA;(5)TPM 高剂量 +FA组:TPM80 mg·kg－1·d－1经口灌胃，同时添加0.7 mg·kg－1·d－1FA［5 组给药剂量均相当于成人等效剂量的10倍(成人按60 kg)］。5组小鼠于分组后第2天，雌鼠开始给药，直至妊娠结束。

1.3 观察指标 观察小鼠给药后状态，对孕鼠于妊娠第22天处死，检查子宫内胚胎数及其发育状况。记录孕鼠体重，着床数、活胎数、死胎数、吸收胎数。测量仔鼠的体重、身长、尾长等。

1.4 统计学分析 应用Instat统计软件，计量资料以表示，采用单因素方差分析，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对孕鼠生殖能力影响 与空白对照组相比较，用的4组着床数差异无统计学意义(P＞0.05)。TPM低剂量组活胎率、吸收胎率和死胎率与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。TPM高剂量组和TPM高剂量+FA组与空白对照组比较活胎率显著降低、吸收胎率和死胎率明显升高(P＜0.01)，TPM高剂量组与TPM高剂量+FA组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 药物对孕鼠生殖能力的影响 n=20，只(%)

2.2 对胎鼠生长发育的影响 与空白对照组相比较，TPM低剂量组、TPM高剂量组与TPM高剂量+FA组胎鼠体重、身长、尾长均显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，TPM低剂量+FA组差异无统计学意义(P＞0.05)。TPM低剂量组与TPM低剂量+FA组相比较，胎鼠体重、身长、尾长差异均有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

表2 药物对胎鼠生长发育的影响n=20，±s

表2 药物对胎鼠生长发育的影响n=20，±s

注:与空白对照组比较，*P ＜0.01;与TPM的剂量组比较，#P ＜0.01

组别 胎鼠体重(g) 胎鼠身长(cm) 胎鼠尾长(cm)空白对照组1.57 ±0.08 2.39 ±0.13 1.17 ±0.06 TPM 低剂量组 1.21 ±0.07* 2.01 ±0.15* 1.01 ±0.09*TPM 高剂量组 1.09 ±0.04* 1.87 ±0.28* 0.98 ±0.07*TPM 低剂量 +FA 组 1.48 ±0.09# 2.15 ±0.27# 1.10 ±0.05#TPM 高剂量 +FA 组 1.22 ±0.06* 2.05 ±0.17* 1.02 ±0.04*

2.3 对胎鼠畸形方面的影响 与空白对照组相比较，TPM高剂量组畸形数明显升高(P＜0.01)，其余组差异无统计学意义(P＞0.05)。TPM高剂量组与TPM高剂量+FA组相比较畸形数差异有统计学意义(P＜0.01)，畸形类型主要表现为唇腭裂、小头、脊膜膨出、短肢等。见表3。

表3 药物对胎鼠畸形方面的影响 n=20

3 讨论

通过本研究发现TPM高剂量对小鼠的生殖能力有明显的毒性影响，补充FA并不能有效拮抗这种毒性作用。TPM低剂量对妊娠期小鼠的生殖毒性作用较小。有报道证实，几乎所有的药物大剂量应用均能影响胚胎的发育［8］。该结果进一步证实了药物对生殖方面的毒性与剂量相关。TPM高、低剂量对胎鼠的生长发育均有影响，补充FA能有效干预低剂量TPM的影响，但对高剂量TPM无明显干预作用。高剂量TPM致畸作用明显，补充FA能有效的拮抗致畸作用。本实验证实TPM对小鼠的生殖能力、生长发育及致畸性均有影响，高剂量尤其明显，妊娠期及时补充FA能起到有效的干预作用。

全世界约有1 800万癫痫女性［9］，癫痫育龄期女性在发作完全控制或控制较好的情况下，要求妊娠的意愿明显增强，因此前瞻性地研究癫痫女性妊娠期用药的安全性以及胎儿先天性畸形的情况就显得尤为重要。目前认为，AEDs有多种致畸机制，而其导致FA代谢障碍是较明确的一种。妊娠期间服用AEDs导致母体及胎儿体内的 FA水平降低，干预胚胎的外胚层分化，使神经管畸形的发生率升高［10］。癫痫孕妇与正常孕妇比较生育低体重儿和早产儿的几率明显升高，这与本次实验结果相符合。

TPM是一种新型、高效的抗癫痫药物，1980年首次在实验室中合成，6年后开始用于治疗癫痫患者，1995年正式在英国上市，1999年获准在我国上市使用［11］。它主要应用于单纯部分发作、复杂部分性发作和全身强直阵挛性发作，尤其对Lennox-Gastaut综合征和West综合征具有较好疗效。它具有阻断钠通道与GABA-A受体相通作用，也具有拮抗FA代谢的药理作用。该药能诱导胚胎甲酰四氢叶酸水平下降，从而引起胚胎细胞分裂异常，导致胚胎停止发育、宫内发育迟缓、流产、畸胎等异常妊娠情况［12］。

FA是由蝶啶、谷氨酸和对氨基苯甲酸组成的B族维生素，是细胞生长和分裂所必需的重要物质［13］。它参与体内一碳单位的转移和代谢，对DNA和RNA的合成以及细胞增殖和组织分化具有重要意义［14］，在核酸、蛋白合成及氨基酸转化过程中也起着重要作用。FA缺乏可引起胎儿神经管发育缺陷，影响胎儿发育［15］。人类自身不能合成 FA，必须依赖食物供给。FA广泛存在于动、植物性食品中，以水果、蔬菜和肉中含量较高。FA易迅速氧化为不可利用的形式，因而在烹调过程中易被破坏［16］。成人FA日需要量为50～100 μg，而妊娠期女性为满足胎儿生长发育每天需要量为400～500 μg［17］。妊娠期女性低血清 FA 浓度会对妊娠期女性及胎儿造成多种不良影响。我国从20世纪80年代末期开始，全国各地区推广服用FA增补剂，已经有效地降低了神经管畸形的发生，使高发地区预防率达到85%，低发地区预防率达到40%［18］。

由于存在种间差异，同一致畸物在不同物种和同一物种的不同品系动物的代谢过程有一定差异，不同物种动物胚胎构造也不尽相同。因此，对小鼠的实验研究结果不能说明对人体的等同作用，需要进一步的深入研究和人群流行病学调查。

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