迟钝爱德华氏菌在水产动物中致病性及致病因子的若干研究

刘双凤

（哈尔滨市农业科学院水产研究分院 黑龙江 哈尔滨150028）

迟钝爱德华氏菌又称迟缓爱德华氏菌或缓慢爱德华氏菌，属于肠杆菌科的爱德华菌属（E d w a r d s i e l l a）。它是该细菌家族中较早发现的成员之一。于1959年由日本的S a k a z a k i和M u r a t a首先从蛇的肠道中分离得到。E.t a r d a是一种革兰氏阴性短杆菌，没有荚膜、芽孢，长度约2~3 μm，直径约l μm，有周生鞭毛，能运动。该菌为兼性厌氧菌，生长温度范围为5~42℃，最适生长温为25~35℃；适宜p H范围为5.5~9.0，但p H7.2时生长较好；耐盐浓度范围为0~4%。同时，E.t a r d a可产H2 S，能在胆硫乳琼脂(D H L)上形成黑色中心的特征菌落。

H o s h i n a于1926年首次从养殖的鳗鲡中分离获得鱼源E.t a r d a分离株，并发现该菌与日本鳗鲡红病（R e d d i s e a s e）有关。近年来，水产养殖的规模化使E.t a r d a成为严重威胁淡、海水鱼类的细菌性病原，给水产养殖业造成巨大经济损失。该菌能引起多种经济鱼种的消化道疾病，其感染引发的出血性败血症被认为是迟钝爱德华氏菌病的典型病症。此外，E.t a r d a病害的地理范围很广泛。我国渤海、黄海、东海沿海海域的养殖场，甚至内陆的淡水鱼、鳖等养殖场都有相关病例报道。另外，E.t a r d a还具有兼性胞内寄生特性，是一种造成人、鱼共患病的机会致病菌，直接威胁人类健康。早在1996年J o r d a n等就报道了人感染E.t a r d a的病例。目前为止，由生食鱼类制品或机体创伤造成的人类感染E.t a r d a病例呈现逐年增长的趋势，且能诱发多种并发症。因此，在全面认识E.t a r d a毒力因子和致病机制的基础上，开发具有自主知识产权的减毒活疫苗，已成为我国乃至整个世界实现可持续发展战略的重要健康保障。

1.1 血清学方面的研究

P a r k e t a l对从养鳗池中分离到的几百株迟钝爱德华氏菌进行血清学实验，发现可以分成4个血清型: A、B、C和D，其中血清型A主要从肾脏中分离所得而且致病力最强。N a k a t s u g a w a首次报道了从牙鲆中分离到了一种无运动性的非典型迟钝爱德华氏菌，可引起牙鲆发病。C o s t a e t a l从鲷中也分离到了这种菌，血清学研究表明这种菌与典型的从其它鱼类分出的菌株有相似的表面抗原，因此认为可以发展一种共同的疫苗针对这两类病原。

1.2 与致病因子有关的研究

迟钝爱德华氏菌致病机理的研究，尚处于起步阶段。寻找研究致病物质是了解病原致病机理的重要环节。

1.2.1 胞外产物

实验证明，水产动物病原菌的胞外产物中具有多种酶活性，其中蛋白酶(明胶酶或酪蛋白酶等)的活性对病原菌的致病性具有重要作用，目前已经发现，杀鲑气单胞菌（A.s a l m o n i c i d a）、嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌（P.a e r u g i n o s a）、荧光假单胞菌（P.f l u o r e s c e n s）、鳗弧菌（V.a n g u i l l a r u m）、溶藻胶弧菌（V.a l g i n o l y t i c u s）、副溶血弧菌（V.p a r a h a e m o l y t i c u s）、创伤弧菌（V.v u l n i f i c u s）、黄杆菌（F l a v o b a c t e r i u ms p.）等多种鱼、虾类病原菌均可产生具有强烈致病作用的胞外蛋白酶。在多数病原菌的胞外产物中发现的蛋白酶都具有热不稳定性，但T h u n e等（1982）发现嗜水气单胞菌可以产生2种胞外蛋白酶，1种为热稳定性蛋白酶，对鲶鱼具有较强的致病力；另1种为热不稳定性蛋白酶，其致病力较弱。T a n a k a等认为，副溶血弧菌产生的胞外蛋白酶是一种诱导酶，在有明胶或其水解产物存在的条件下，蛋白酶的产生量为非诱导条件下的40倍左右在细菌的生长早期，蛋白酶的分泌几乎完全缺乏，到了生长后期便开始迅速增加。

H o s h i n a报道称热灭活的迟钝爱德华氏菌细胞对日本鳗鲡有致死作用，但培养液上清无致死作用。而S u p r a t o e t a l研究发现，该菌细胞内容物和胞外产物都有致死作用，而胞外产物是直到细菌培养后期才有致死作用，认为是由于后期发生溶细胞作用使内容物释放导致。S u p r a p t o e t a l从该菌的E C P（胞外产物）和I C C（胞内成分）中分离到一种具有蛋白水解酶活性的物质，对鳗有致死作用。陆承平证实迟钝爱德华氏菌的胞外产物的的细胞毒性与动物致病性平行，说明胞外产物是一种毒力因子。

1.2.2 内毒素和外毒素

H o s h i n a认为，迟钝爱德华氏菌起致病作用的主要为内毒素。U l l a h等报道，迟钝爱德华氏菌能产生外毒素，该毒素能使兔发生皮肤坏死。J a n d a等发现，迟钝爱德华氏菌培养上清对H E p-2细胞有毒性。S u p r a p t o等报道，迟钝爱德华氏菌同时存在内毒素和外毒素。另外发现了两种外毒素，一种可引起兔皮肤红斑，另一种可引起兔浮肿和溃疡性红斑。C h u n g e t a l从该菌中发现了几种具有磷脂酶活性的外毒素，分别对磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和鞘磷脂等有特异活性。M a t h e w l e t a l利用基因突变的方式进行研究，发现迟钝爱德华氏菌的芳基硫酸酯磺基转移酶（a r y l s u l f a t e s u l f o t r a n s f e r a s e）基因和过氧化氢酶前体蛋白（c a t a l a s e p r e c u r s o r）基因发生突变时都可引起迟钝爱德华氏菌毒性的大大降低。

1.2.3 溶血素

溶血素是多数病原菌的重要致病因子之一，目前已在杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、副溶血弧菌以及铜绿假单胞菌等病原菌的胞外产物中检测到。Y a n a g a s e等认为，副溶血弧菌产生的多种酶类均可引起溶血作用，包括磷脂酶A，溶血磷脂酶及其它2种直接溶血因子，一种为热稳定性因子，另一种为热不稳定性因子根据N o m u r a和S a i t o的结论，溶血素最初可能是以一种没有溶血活性的前体形式存在，至细菌生长的对数后期，在细胞内形成并结合在细胞内膜上;至细菌生长稳定期，随着细胞的自溶裂解而释放到培养基中。

J a n d a等（1993）报道，E T溶血素呈细胞结合状态，在常规条件下只有少量分泌到胞外，当外界环境缺铁时，胞外溶血素的分泌量是常规条件下的3～40倍。C h e n&H u a n g发现迟钝爱德华氏菌可以分泌一种溶血素可以使罗非鱼红细胞壁产生孔洞。陆承平等报道，E T能产生两种类型溶血素，即细胞结合性溶血素和胞外溶血素。培养基中加入螯合剂E D D A，造成外界环境缺铁，E T21、S A8318、J F、122、735这5株出现两种情况，两株（E T21、S A8318）的胞外溶血素分泌显著增加，而其余三株（J F、122、73）胞外溶血素的分泌无明显变化。可见，E t产生溶血素的机制有一定的复杂性，细胞结合性溶血素的分泌未必受铁调控，这J a n d a等的说法有异，有待进一步证实。

1.2.4 侵袭素（粘附素）

U l l a h&A r a i在研究的菌株中没有发现专门的侵袭素或粘附素，只是发现了一种粘性物质可能与粘附和抵抗宿主的进攻有关系。欧阳志明等报道，15株E T均能凝集红细胞，但只有10株能粘附H e p-2细胞，其粘附能被纯化的鞭毛所抑制。综上分析，E T的粘附素组成较复杂，至少包括血凝素蛋白和鞭毛蛋白，不属于一种结构多种功能的模式。E T作为一种肠道致病菌，对宿主肠粘膜上皮是否也能像对H E p-2细胞一样具粘附作用，其粘附素及其受体是否与体外模型显示的结果一致，均有待进一步证实。

L i n g e t a l利用绿色荧光蛋白(G F P)研究体外迟钝爱德华氏菌对鲤鱼上皮瘤细胞的粘附与入侵，发现该菌的内化需微丝和蛋白酪氨酸激酶的作用，蛋白激酶C抑制剂可加速非毒性菌株的内化，M A P K抑制剂则可阻碍毒性菌株的入侵。这为研究该菌与宿主关系提供了一种有用的工具，即绿色荧光蛋白。L i n g e t a l又利用G F P标记的该菌研究发现，肠道、鳃和体表是该菌入侵的位点。

1.3 其它

M i n a g a w a e t a l称一年四季都可从日本鳗鲡养殖池的水样和泥样中分离得到迟钝爱德华氏菌，并且随水温的升高，分离到的菌的数量也越多。I s h i h a r a&K u s u d a研究发现水温高时，从注射过迟钝爱德华氏菌的日本鳗鲡体内释放病原的速度要比在低温时快，若死去的鱼体留在水中则水中的病原数量会迅速提升，比取走死鱼的水中菌量高3个数量级。

综上所述，尽管国内外对迟钝爱德华氏菌进行了大量的研究，但其治病机理仍没有彻底搞清。在防治方面，由于使用抗生素类药物的弊端，积极发展非抗生素类药物势在必行;而传统免疫的方法从目前的研究状况看，效果不是很理想;营养免疫，从提高宿主本身的抗病机能出发，是一个比较好的发展方向;生物防治，从生态学角度出发，从根本上改善养殖环境，防止病害的发生，是很有发展前景的途径，但这一研究方向正处于初级阶段，而且有较高的条件要求，所以还有大量的工作要做。鉴于该菌能够导致多种严重的人类疾病，对该菌进行深入的研究，防止和减少水产养殖中该病的发生，对于保护生产和保护人类健康都具有极其重要的义。