复合诱变选育高产富硒酵母

关亚鹏，娄　忻，张　莉，张雪霞，时　蕾

(华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，河北 石家庄 050015)

硒元素具有重要的生理功能，作为一种人体必需的微量元素已经引起人们的高度重视。人体缺硒会导致癌症、心肌梗塞等多种重大疾病，而天然食品中的硒含量普遍较低[1-2]。目前，补充硒的方式主要有两种：无机硒和有机硒。无机硒主要以亚硒酸钠为主，但其毒性远大于有机硒，而酵母本身的营养丰富，且转化无机硒的能力也很强，所以通过富硒酵母补充硒元素是一种安全有效的途径[3-5]。

目前，国内关于富硒酵母诱变方法的研究比较多，如采用紫外诱变、硫酸乙二酯(DES)诱变、60Co-γ射线辐照等物理和化学方法[6-8]。近年来，氦氖激光诱变在微生物遗传育种方面的应用越来越多。氦氖激光诱变机理尚不明确，可能的原因是激光的穿透作用使细胞内的一些重要物质发生不可逆的变化，导致细胞内各种代谢机制紊乱，代谢过程受阻，表现为细胞分裂迟缓或死亡[9-10]。作者在此采用紫外诱变结合氦氖激光辐照诱变方法筛选到了一株高产富硒酵母。

1　实验

1.1　菌种、培养基与仪器

酿酒酵母FX-12-135，自行保存。

分离培养基：葡萄糖，蛋白胨，酵母粉，琼脂。

种子培养基：葡萄糖，酵母粉等。

发酵培养基：蔗糖，蛋白胨，酵母粉。

紫外灯(30 W)；He-Ne-1000型氦氖激光仪。

1.2　诱变方法

1.2.1菌悬液的制备

将初始菌种成熟斜面加入无菌水，刮下菌体，经振荡、玻璃珠打散，过滤后制成菌悬液，逐级稀释至适宜浓度，待用。

1.2.2紫外诱变处理

将菌悬液置于平皿中，在距离紫外灯32 cm处进行30～180 s的照射处理，时间间隔为30 s。将照射后的菌悬液稀释到一定浓度，涂布于固体培养基上培养，挑选菌落，进行初筛和摇瓶筛选，以未经紫外线照射的菌液作为对照，计算致死率；根据摇瓶筛选结果计算正突变率，正突变率以富硒水平高于出发菌种水平的突变株数量计算。

1.2.3氦氖激光诱变处理

取适量菌悬液置于无菌的石英小皿中进行氦氖激光(功率18 mW，距离20 cm)辐照，辐照时间分别为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min；将处理菌液稀释至合适浓度，取适量涂布于固体平板上，28 ℃培养2 d，待菌落成熟后进行菌落初筛和摇瓶筛选，根据摇瓶筛选结果计算菌种的正突变率。

1.3　初筛和摇瓶筛选

以菌落大小和菌落形态作为筛选指标，挑选生长快、直径较大的单菌落转接于正常固体平板(不含硒)和含硒(300 μg·g-1)平板上，并做好标记，位置一一对应。单菌落培养2 d后，选取在含硒平板上长势良好、颜色微红的单菌落对应的正常固体培养基上的单菌落传斜面培养。然后进行摇瓶复筛，发酵过程中补加一定量的亚硒酸钠，发酵结束测定有机硒含量。

1.4　干酵母的制备

取一定量摇瓶发酵液，在3 000 r·min-1条件下离心10 min，去上清，加入一定量蒸馏水，洗涤、离心菌体，反复操作3次，得到新鲜酵母，于80 ℃烤箱内干燥6 h，即得到干酵母。

1.5　硒含量的测定[11]

采用3，3-二氨基联苯胺比色法测定酵母中有机硒含量(μg·g-1)。

2　结果与讨论

2.1　紫外诱变突变株的筛选

初始菌株FX-12-135经不同时间紫外诱变后的致死率和正负突变率见表1。

表1紫外诱变时间对初始菌种FX-12-135生长的影响

Tab.1EffectsofUVmutationtimeongrowthoforiginalstrainFX-12-135

紫外诱变时间/s致死率/%正突变率/%负突变率/%303115896604956513190627811571208861331091509691149218099833118

由表1可见，随着紫外诱变时间的延长，菌株的致死率逐渐上升；当紫外诱变时间为120 s时，菌株的致死率比较适宜，正突变率最高，达到了13.3%；当诱变时间为180 s时，菌株的致死率接近100%，正突变率很低。因此，确定最佳紫外诱变时间为120 s。

初始菌株FX-12-135的菌悬液经紫外照射120 s后涂布平板，挑选155个培养成熟的单菌落进行菌落初筛和摇瓶筛选，得到21支相对高富硒菌株，挑选其中10支高产菌株进行复试验证，得到菌株UV-13-62，经3批摇瓶复试验证其富集有机硒能力比出发菌株提高11.6%。

2.2　氦氖激光诱变突变株的筛选

将紫外诱变得到的菌株UV-13-62斜面制成菌悬液，经不同时间的氦氖激光辐照后，摇瓶筛选计算菌株的正突变率。氦氖激光辐照时间对菌株UV-13-62生长的影响见图1。

图1　氦氖激光辐照时间对菌株UV-13-62生长的影响

由图1可见，在20～60 min时菌株的正突变率随着氦氖激光辐照时间的延长而增大；辐照时间为60 min时，正突变率最高；超过60 min后，正突变率下降。因此，确定氦氖激光最佳辐照时间为60 min。

选取氦氖激光辐照60 min的219个单菌落培养2 d，进行菌落初筛和摇瓶筛选，得到36支正突变菌株，挑选富硒水平高于出发菌株UV-13-62 10%以上的15支菌株进行3批摇瓶复试，以有机硒含量为筛选指标，筛选得到了一株高产菌株HN-14-109，其富集有机硒能力比UV-13-62提高16.3%，比初始菌株FX-12-135累计提高29.8%。

2.3　复合诱变突变株遗传稳定性研究

对菌株HN-14-109连续传代3次，4代斜面同时进行摇瓶发酵，考察其遗传稳定性，结果见表2。

表2菌株HN-14-109的遗传稳定性

Tab.2GeneticstabilityofstrainHN-14-109

传代数F1F2F3F4相对硒含量/%100010261015983

由表2可看出，4代斜面菌株发酵后的有机硒含量波动不大，说明菌株HN-14-109没有发生回复突变，具有比较稳定的遗传特性。

3　结论

以酿酒酵母FX-12-135为初始菌株，以有机硒含量为筛选指标，筛选高产富硒酵母菌。首先采用紫外诱变方法处理菌株，然后利用氦氖激光辐照处理进行选育,得到一株高产突变株HN-14-109，其摇瓶富硒能力比初始菌株提高29.8%，且遗传特性稳定。表明紫外诱变复合氦氖激光辐照是提高酵母富硒能力的有效方法。

参考文献：

[1]贾洪峰,贺稚非,刘丽娜.富硒酵母的研究进展[J].四川食品与发酵,2005,41(3):8-12.

[2]范秀英,郭雪娜,傅秀辉,等.高生物量富硒酵母的选育及培养条件初步优化[J].生物工程学报,2003,19(6):720-724.

[3]吴竞,王阳光,刘永杰,等.不同酵母菌种富硒能力比较与发酵条件优化[J].畜牧与兽医,2012,44(1):15-18.

[4]刘杰,徐林,吴根富.富硒酵母的研究进展[J].饲料工业,2009,30(22):44-48.

[5]原国强,杨辉,梁海秋,等.富硒酵母的选育及其发酵条件的优化试验[J].食品科技,2007，(5):25-28.

[6]刘莉君,程茂基,杜波,等.紫外线诱变选育高产富硒酵母的研究[J].当代畜牧,2007，(6):29-30.

[7]朱昌雄,马爱民,刘代武,等.富硒酵母菌株的选育[J].酿酒科技,2007,(1):46-49.

[8]邱美珍,杜丽飞,王红兵,等.60Co-γ射线诱变选育富硒酵母菌株[J].激光生物学报,2011,20(3):378-381.

[9]葛菁萍,孙红兵,王轶男,等.氦氖激光和亚硝基胍复合诱变选育高产乙醇的休哈塔假丝酵母[J].激光生物学报,2011,20(3):292-298.

[10]葛菁萍,陈方博,王海曼,等.He-Ne激光和亚硝基胍复合诱变米曲霉提高其蛋白酶和淀粉酶活力[J].食品科学,2011,32(11):243-247.

[11]贺立东. 分光光度法测定富硒酵母中有机硒的含量[J]. 食品工业科技, 2000, 21(5):67-68.