氨基树脂固定化S-腺苷甲硫氨酸合成酶的研究

尹春丽，曹珊珊，许　乐，陶贵荣，牛卫宁

(1.西安文理学院生命科学系，陕西 西安710065；2.西北工业大学生命学院，陕西 西安 710072)

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)作为药品和保健品已得到广泛应用[1-2]，其制备方法主要有酵母菌发酵法和体外酶促转化法。与酵母菌发酵法相比，体外酶促转化法合成SAM具有生产周期短、底物转化率高、纯化工艺简单以及环境友好等优点，具有良好的工业化应用前景[3]。目前，体外酶促转化法合成SAM需要解决的关键问题是大量廉价SAM合成酶的获得以及选择合适的载体固定化SAM合成酶，以大幅提高固定化酶的稳定性和重复使用批次。

作者在前期研究中构建了组成型表达SAM合成酶的重组大肠杆菌[4]，并对SAM合成酶进行了固定化研究。结果表明，通过海藻酸钙包埋法和壳聚糖-戊二醛交联法得到的固定化酶的机械强度较低，重复使用过程中容易破碎[5-7]。而Luo等[8]使用镍离子亲和层析介质固定的酿酒酵母SAM合成酶也存在酶活力回收率低以及固定化酶重复使用批次少等不足。

氨基树脂作为一种人工合成的多聚物，具有机械强度高、酶载量大等优点，已经被广泛用作固定化酶载体[9-10]。作者使用氨基树脂载体对SAM合成酶进行了固定化研究,优化了酶的固定化条件并对固定化酶的性质进行了研究，以期开发适用于工业化应用的固定化酶，为酶法工业化生产SAM奠定基础。

1　实验

1.1　菌种、材料与试剂

重组大肠杆菌E.coliJM109(pBR322-SAMS)，本研究室构建[4]。

苯基琼脂糖凝胶预装柱(Phenyl-Sepharose Fast Flow)，美国GE公司；Seplite LX-1000HA型氨基树脂，西安蓝晓科技有限公司。

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)标准品，美国Sigma公司；其余试剂均为分析纯。

1.2　SAM合成酶液的制备

SAM合成酶的表达和纯化参照文献[11]进行，步骤如下：

大肠杆菌E.coliJM109(pBR322-SAMS)在含有15μg·mL-1四环素的LB培养基中30 ℃过夜培养至稳定期，离心收集菌体并超声破碎细胞，破碎上清液加入0.75 mol·L-1硫酸铵进行盐析沉淀；离心后上清液再经过苯基琼脂糖凝胶预装柱疏水层析，缓冲溶液(50 mmol·L-1Tris-HCl,pH值8.0)洗脱得到SAM合成酶液，酶活力为32 U·mg-1。

1.3　SAM合成酶的固定化

去离子水洗涤氨基树脂3次，加入不同体积分数的戊二醛水溶液，室温振荡交联5 h，去离子水充分洗涤交联载体；然后加入适量纯化的SAM合成酶液，在室温(25 ℃，下同)下吸附交联，弃去上清液，去离子水洗涤3次，抽滤后得到固定化SAM合成酶，4 ℃保存。

1.4　固定化SAM合成酶催化合成SAM

在5 mL SAM合成反应液(100 mmol·L-1Tris-HCl、100 mmol·L-1KCl、40 mmol·L-1MgSO4、26 mmol·L-1L-Met、20 mmol·L-1ATP、0.6 mol·L-1对甲基苯磺酸钠，pH值7.0)中加入0.5 g固定化SAM合成酶,35 ℃摇床振荡反应8 h，高效液相色谱(HPLC)分析反应液SAM浓度。反应后将固定化酶洗涤重复使用。

1.5　酶活力的测定

酶活力的测定参照文献[11]进行。

酶活力单位(U)定义为：37 ℃下，1 h催化形成1μmol SAM所需要的酶量。

酶活力回收率定义为：固定化酶的总活力与固定化前游离酶总活力的比值。

2　结果与讨论

2.1　SAM合成酶固定化条件的优化

2.1.1戊二醛体积分数对SAM合成酶固定化的影响

用不同体积分数的戊二醛水溶液10 mL在室温下处理0.5 g氨基树脂5 h，抽滤洗涤后加入2 mg·mL-1SAM合成酶液10 mL，室温交联8 h，测定固定化酶酶活力及酶活力回收率，结果如图1所示。

图1　戊二醛体积分数对固定化酶酶活力及酶活力回收率的影响

由图1可知，当戊二醛体积分数为5 %时，固定化酶酶活力及酶活力回收率达到最大值。戊二醛体积分数与氨基树脂表面醛基的含量正相关，树脂表面偶联的醛基较少时，固定的酶量不足，导致固定化酶酶活力较低；偶联的醛基过多时，可导致SAM合成酶变性。因此，最佳戊二醛体积分数为5 %。

2.1.2酶添加量(酶与树脂的比例，mg·g-1，下同)对SAM合成酶固定化的影响

将经过戊二醛处理的氨基树脂0.5 g与不同添加量的SAM合成酶液交联反应8 h，测定固定化酶酶活力与酶活力回收率，结果如图2所示。

图2　酶添加量对固定化酶酶活力及酶活力回收率的影响

由图2可知，当SAM合成酶添加量大于20 mg·g-1时，固定化酶酶活力趋于稳定，继续增加酶量，固定化酶酶活力不再显著增加；而酶活力回收率却大幅下降。这是由于载体表面的醛基结合位点已经趋于饱和。因此，最佳酶添加量为20 mg·g-1。

2.1.3固定化时间对SAM合成酶固定化的影响

将经过戊二醛处理的氨基树脂0.5 g与5 mL 2 mg·mL-1SAM合成酶液在室温下交联反应一定时间，测定固定化酶酶活力及酶活力回收率，结果如图3所示。

图3　固定化时间对固定化酶酶活力及酶活力回收率的影响

由图3可知，当固定化时间为5 h时,固定化酶酶活力达到最大值476.8 U·g-1，酶活力回收率为74.5%。继续延长固定化时间，固定化酶酶活力及酶活力回收率开始缓慢下降,这可能是由于载体表面交联的酶量过大，导致反应底物和产物的传质性降低。因此，最佳固定化时间为5 h。

2.2　固定化SAM合成酶的性质

2.2.1热稳定性

将游离和固定化SAM合成酶在不同温度下孵育5 h后测定并计算相对酶活力，结果如图4所示。

图4　游离和固定化SAM合成酶的热稳定性

由图4可知，相对于游离SAM合成酶，固定化酶的热稳定性明显提高；在50 ℃下孵育5 h固定化酶酶活力仍保留了61.2%，而游离酶则完全失活。表明氨基树脂固定化SAM合成酶的热稳定性与壳聚糖固定化SAM合成酶相似[7]，但明显高于海藻酸钙包埋法固定的SAM合成酶[5]。

2.2.2pH值稳定性

将游离和固定化SAM合成酶在不同pH值缓冲溶液中4 ℃保存12 h后测定并计算相对酶活力，结果如图5所示。

图5　pH值对游离和固定化SAM合成酶稳定性的影响

由图5可知，固定化SAM合成酶在pH值8.0的缓冲溶液中最稳定，而游离酶在pH值7.5的缓冲溶液中最稳定；在pH值为7.0～7.5的缓冲溶液中，游离SAM合成酶的稳定性略高于固定化酶，在pH值为6.0～6.5、8.0～9.5的缓冲溶液中固定化SAM合成酶的稳定性均明显高于游离酶。这可能是因为，酶被固定在树脂上，其构象变得更加刚性和稳定，导致缓冲溶液pH值对酶活力的影响减弱。

2.2.3米氏常数(Km)

2.2.4操作稳定性

将固定化SAM合成酶连续催化反应10批次，每批次反应后测定并计算相对酶活力，结果如图6所示。

图6　固定化SAM合成酶的操作稳定性

由图6可知，随着反应批次的增加，固定化SAM合成酶酶活力逐渐下降，连续反应10批次后，酶活力保留86.3%；而壳聚糖固定化SAM合成酶连续催化反应5批次后，酶活力仅残留64%[7]。表明氨基树脂固定化SAM合成酶具有更优的操作稳定性。

2.2.5储存稳定性

将游离和固定化SAM合成酶在4 ℃冰箱中分别保存15 d和30 d后测定保留酶活力。结果发现：游离SAM合成酶保存15 d后酶活力仅保留14.6%，保存30 d后检测不到酶活力；而固定化SAM合成酶保存15 d和30 d后酶活力仍保留92.6%和 81.4%。表明氨基树脂固定化SAM合成酶的储存稳定性得到大幅提高，并且优于壳聚糖固定化SAM合成酶[7]。

3　结论

以氨基树脂为载体对SAM合成酶进行固定化。优化的固定化条件为：戊二醛体积分数5%、SAM合成酶添加量20 mg·g-1、固定化时间5 h。所制备的固定化SAM合成酶连续催化反应10批次，酶活力仍保留86.3%。该固定化SAM合成酶具有酶活力回收率高、操作稳定性好及便于储存等优点。

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