传统BCG初免IL-12联合Ag85A DNA疫苗加强序贯免疫小鼠效果观察

王 婵，王新敏，季 榕，张宇晴，王飞雨，吴江东，吴 芳，张万江，章 乐

结核仍是目前人类健康的一个巨大威胁, 据WHO统计,2010年全球有145万人死于结核杆菌的感染[1]。结核杆菌卡介苗(BCG)是目前唯一可获得的预防结核病疫苗,但随着耐多药结核杆菌菌株的出现以及人类免疫缺陷病毒(HIV)合并结核杆菌交叉感染病例的增多,加快发展新型的疫苗是缓解这一全球性公共卫生问题的有效措施[2]。但大多数研究数据显示，新型DNA疫苗的效用与BCG相比，优势并不是特别明显，完全替代的可能性不大。因此，新免疫策略的研制对防治结核杆菌感染及结核病的发生其作用非凡。

国内外学者通过大量的动物试验和临床研究,针对BCG免疫保护的缺陷和新型疫苗研制的困镜,BCG的序贯免疫策略(sequential immunization strategy)又称初免-加强免疫策略(prime-boost regimen)[3]被提出用于TB的预防。即当单用一种疫苗产生的免疫效力不足时，使用相同或不同的疫苗来重复免疫接种可增强免疫效果。因而有研究者以表达免疫调节因子的质粒与表达病原体保护性抗原的质粒共同免疫, 希望通过细胞因子的免疫调节作用及佐剂作用增强宿主的特异性免疫应答, 从而产生有效的免疫保护作用[4]。

研究显示, IL-12 在体内外均能高效刺激并维持早期 Thl 型细胞应答, 可作为结核病疫苗的佐剂,其免疫调节作用和佐剂作用能增强宿主的特异性免疫应答,从而产生有效的免疫保护作用[5-6]。而结核分枝杆菌Ag85A是结核分枝杆菌的早期培养液分泌蛋白中具有较强免疫保护作用的抗原成分，分别含有多个不同的T、B细胞表位，能诱导机体产生保护性细胞和体液免疫，是研究最多的TB候选DNA疫苗[7]。因此本研究利用BCG初免，加上已经构建好的表达免疫调节因子的质粒(IL-12)联合结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗加强免疫的序贯免疫策略对小鼠的免疫效果进行观察。

1 材料和方法

1.1材料6～8周龄BALB/c雌性小鼠42只，由本校实验动物中心提供。pcAg 85A是以pcDNA3.1真核质粒为载体构建的表达型重组质粒，由本实验室构建保存。IL-12是以pcDNA3.1真核质粒为载体构建的表达型重组质粒，由本实验室构建保存。BCG由本实验室常规保存培养。Endo-free Plasmid Mini KitⅡ质粒小量抽提试剂盒购自Omega公司；TB-PPD购自北京祥瑞生物制品公司；小鼠干扰素γ(IFN-γ)、IL-4、IL-2细胞因子检测试剂盒购自Bio-source；HRP标记的羊抗鼠IgG购自北京博瑞克公司；XTT购自BBI公司。

1.2方法

1.2.1DNA疫苗的制备 按照Endo-free Plasmid Mini Kit Ⅱ质粒小量抽提试剂盒说明书大量抽提质粒IL-12、pcDNA3.1及pcAg 85A，以紫外分光光度计定量后，用PBS调整浓度为1.25 g/L备用。

1.2.2动物免疫 将42 只小鼠随机分为7组，A组：PBS对照组，B组：BCG组，C组：pcAg85A 组，D组:BCG/ pcAg85A组，E组：BCG/ pcAg85A +IL-12 组，F组：BCG/IL-12组，G组: BCG/pcDNA3.1组，每组6只小鼠。

A组小鼠在1周、3周、5周均注射PBS作为阴性对照；B组1周注射BCG，3、5周注射PBS；C组分别在1、3、5周以质粒pcAg 85A免疫小鼠；D组小鼠在1周注射BCG，3、5周注射质粒pcAg 85A加强;E组1周注射BCG，3、5周注射质粒pcAg 85A和质粒IL-12加强；F组小鼠在1周注射BCG，3、5周注射质粒IL-12加强；G组小鼠在1周注射BCG，3、5周注射质粒pcDNA3.1加强作为对照。BCG菌悬液0.2 mL(106cfu/ mL) 于皮下注射，IL-12、pcDNA3.1、pcAg 85A以7.5 g/L布比卡因递送，于胫前肌多部位注射，共50 μL，每只共计100 μg质粒。

1.2.3特异性抗体IgG的检测(ELISA法) 分别于小鼠加强免疫后4周，6周，8周摘除眼球取血，分离血清后-20 ℃冻存备用。以TB-PPD标准品(1 mg/L)100 μL/孔包被酶标板，4 ℃过夜，加5 g/L脱脂奶粉封闭2 h，再次洗板后，依次加入倍比稀释的待测血清，洗板后加入1∶1 000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG， OPD显色后于波长450 nm测定吸光度(A490)值。以PBS组小鼠血清作为阴性对照，A490值>0.05，A实验组/A对照组≥2.0时，判为阳性。将抗体滴度定义为：实验组和阴性对照组A490比值≥ 2.0时为最大的血清稀释倍数。

1.2.4特异性淋巴细胞增殖实验(XTT法) 分别于加强免疫后4周，6周，8周，每组分别取2只小鼠，无菌条件下分离小鼠脾脏。每组小鼠脾细胞混合后进行细胞计数，以10%小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为4×106/L，100 μL/孔加入96孔细胞培养板。同时设对照孔和调零孔，实验组每孔加入PPD(1 μg/mL)进行刺激，于37 ℃ 5% CO2孵箱中培养72 h后，取出培养板，每孔加入XTT(5 g/L)4 μL以及VK32 μL(终浓度0.1 mmol/L)，继续培养4h后终止培养，在酶标仪上测定A450nm吸光值，结果用刺激指数(stimulation index, SI)表示。SI=A实验值/A对照组。

1.2.5细胞因子的诱生和测定 同样制备的脾细胞调整密度为2×106/L，100 μL/孔加入96孔细胞培养板。每组小鼠脾细胞做6个复孔，每孔加入TB-PPD标准品(1 mg/L)100 μL进行刺激。于37 ℃ 5% CO2孵箱中培养72 h，收集细胞培养液，离心取上清。IFN-γ和IL-4检测采用Bio-Source ELISA试剂盒，按说明书操作，检测样品中IFN-γ和IL-4、IL-2含量。

2 结 果

2.1各组血清特异性抗体IgG的比较 用ELISA法对各组小鼠血清中抗TB-PPD抗体水平进行了测定。免疫后4周，8周，BCG组， Ag85A , BCG/ Ag85A , BCG/ Ag85A+IL-12 , BCG/ IL-12组BCG/ pcDNA3.1在3个时间段的IgG与同时间段PBS组比较均有显著性差异(P<0.05)。其中， BCG/ Ag85A+IL-12组IgG高于其它各组(P<0.05)(图1)。

2.2特异性脾淋巴细胞增殖实验 加强免疫后4周，6周，8周的小鼠脾细胞在体外经PPD刺激后，BCG组，Ag85A ,BCG/ Ag85A , BCG/ Ag85A+IL-12 , BCG/ IL-12组BCG/ pcDNA3.1在3个时间段的增殖活性与同时间段PBS组比较均有显著性差异(P<0.05)。其中,BCG/ Ag85A+IL-12组小鼠脾淋巴细胞的增殖显著高于其它各组(P<0.05)(图2)。与加强免疫后4周相比，加强免疫后6周，8周 BCG/ Ag85A,BCG/ Ag85A+IL-12,BCG/ IL-12组小鼠脾淋巴细胞的增殖均呈上升趋势，并且在加强免疫后8周达到较高水平。

图1特异性抗体IgG的检测

Fig.1Analysisofantibodyresponsesagainsttuberculin-purifiedproteinderivative(TB-PPD)

A: PBS group; B: BCG group; C: pcAg 85A group; D: BCG/pcAg 85A group; E: BCG/ pcAg85A +IL-12 group;F: BCG/IL-12 group;

G: BCG/pcDNA3.1group.

*P<0.05 vs PBS, BCG, Ag85A group; #P<0.05 vs BCG/ Ag85A group; △P<0.05 vs BCG/ IL-1.

图2特异性脾淋巴细胞增殖实验

Fig.2Lymphoproliferativeresponsetothesetypesofvaccines.

A: PBS group; B: BCG group; C: pcAg 85A group; D: BCG/pcAg 85A group; E: BCG/ pcAg85A +IL-12 group; F: BCG/IL-12 group;

G: BCG/pcDNA3.1 group.

*P<0.05 vs PBS, BCG, Ag85A group; #P<0.05 vs BCG/ Ag85A group; △P<0.05 vs BCG/ IL-12.

2.3IFN-γ表达水平 加强免疫后IFN-γ水平BCG/ Ag85A+IL-12组在3个时间段均高于其它各组(P<0.05)。从免疫6周开始，BCG/ Ag85A和 BCG/ IL-12组得IFN-γ水平高于PBS组，BCG组，Ag85A组(P<0.05)。BCG/ IL-12组显著高于BCG/ Ag85A，但免疫8周后，BCG/ IL-12组和BCG/ Ag85A 组无显著性差异(表1)。

表1IFN-γ变化水平

GroupIFN-γ (pg/mL)4-week6-week8-weekPBS62.2±10.2659.2±7.9861.6±7.99 BCG88.4±9.45∗99.6±11.28∗115.6±14.59∗ Ag85A101.6±18.47∗110.2±17.74∗135.6±18.69∗ BCG/ Ag85A118±14.4ab∗#128±14.58∗#△170±22.93∗#△ BCG/ Ag85A+IL12128.2±20.4∗△190.2±16.51∗#△244.2±39.14∗#△BCG/ IL12106.4±24.14∗146.4±14.12∗#165.6±27.39∗# BCG/ pcDNA3.185.8±9.33∗99±10.63∗104.2±23.96∗

Note: *P<0.05 vs PBS, BCG, Ag85A group; #P<0.05 vs BCG/ Ag85A group; △P<0.05 vs BCG/ IL-12.

2.4IL-2表达水平 加强免疫后IL-2水平BCG/ Ag85A+IL-12组在3个时间段均高于其它各组(P<0.05)。从免疫6周开始，BCG/ Ag85A和 BCG/ IL-12组得IL-2水平高于BCG组，Ag85A组(P<0.05)。免疫8周时，BCG/ IL-12组分泌的IL-2高于BCG/ Ag85A 组，有显著性差异(表2)。

表2IL-2变化水平

GroupIL-24-week6-week8-weekPBS29.8±2.7725.8±4.7627.6±3.13BCG108.2±17.54159.4±21.69223±13.11acdeAg85A111±16.85160.1±21.06186.4±11.52BCG/ Ag85A123±10.07224.2±18.99∗277.6±16.09∗△BCG/ Ag85A+IL-12146.2±17.29∗#△271.6±16.36∗#△419.3±28.12∗#△BCG/ IL-12123.6±19.63227.4±23.46∗312.4±33.02∗#BCG/ pcDNA3.1107.2±14.02152.6±21.38219.4±18.15

Note: *P<0.05 vs PBS, BCG, Ag85A group, #P<0.05 vs BCG/ Ag85A group;

△P<0.05 vs BCG/ IL-12.

2.5IL-4表达水平 加强免疫后IL-4水平BCG/Ag85A+IL-12组在3个时间段均高于其它各组(P<0.05)。从免疫2周开始，BCG/Ag85A组得IL-4水平高于BCG组，Ag85A组(P<0.05)。并且其IL-4明显高于BCG/IL-12组(表3)。

3 讨 论

表3IL-4变化水平

Tab.3ChangesofIL-4levelinculturemediumtothesetypesofvaccines(X±S,pg/mL,n=5)

GroupIL-44-week6-week8-weekPBS23±5.719.6±2.4114.2±2.59BCG41±6.6357.6±7.8971±2.55Ag85A32.6±4.7243.4±5.3253.2±6.22BCG/ Ag85A59.2±5.07∗△62±4.36△82.8±8.26∗△BCG/ Ag85A+IL-1268.6±6.62∗#△96.6±5.5∗#△117.4±10.71∗#△BCG/ IL-1247.2±5.45#51.4±7.23#63.8±8.79#BCG/ pcDNA3.137.4±3.2154.2±7.0566.2±6.98

Note: *P<0.05 vs PBS, BCG, Ag85A group; #P<0.05 vs BCG/ Ag85A group; △P<0.05 vs BCG/ IL-12.

作为细胞介导免疫中具有重要作用的细胞因子—IL-12具有促进细胞毒T淋巴细胞(CTL)成熟、诱导早期辅助性T母细胞(Thnaive)分化为Th1细胞、刺激T细胞和激活自然杀伤细胞(NK)使其分泌IFN-γ,并增强它们的裂解活性等作用。它能促进T辅助细胞的极化过程向着Th1的方向进行,在抗结核分枝杆菌感染中具有重要作用。同时IL-12对维持一定数量的Th1记忆细胞也是必需的[10]。研究发现将IL-12作为基因佐剂与分枝杆菌保护性抗原的真核表达质粒联合免疫小鼠,可诱导机体产生更加有效的免疫保护作用[11]。

本研究结果表明,诱发TB-PPD特异性IgG抗体反应,BCG/Ag85A+IL-12免疫组小鼠血清特异性抗体增加最明显，表明采用BCG初免，Ag85A+IL-12联合免疫的序贯免疫策略后，能提高特异性体液免疫和细胞免疫。而BCG/Ag85A+IL-12免疫4周后IgG水平开始升高，且6周或8周后小鼠血清中抗PPD IgG水平仍显著高于其他各免疫组(P<0.05)(图1)，进一步表明实验组BCG/Ag85A+IL-12产生的抗体较持久，并随着时间的延长明显增高。淋巴细胞增殖转化是观察细胞免疫功能的指标之一，结果显示，在BCG初次免疫的基础上，各免疫组抗原特异性脾淋巴细胞均有增殖。与加强免疫后4周相比，虽然加强免疫后6周，8周BCG/Ag85A，BCG/IL-12组小鼠脾淋巴细胞的增殖均呈上升趋势，并且在加强免疫后8周达到较高水平。但BCG/Ag85A+IL-12免疫组小鼠脾淋巴细胞的增殖在各个时间段都显著高于其它各组(P<0.05)(图2)。这些结果表明，BCG初次免疫后，再用pcAg85A和IL-12联合加强免疫，小鼠脾淋巴细胞发生了显著的增殖转化，其结果优于其他的免疫方式。

进一步研究显示，采用BCG/Ag85A+IL-12联合加强免疫小鼠后,可诱导较强的淋巴细胞增殖,产生高水平的Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2,超过BCG/Ag85A组、BCG/IL-12组和BCG组(P<0.05)，这与小鼠脾淋巴细胞体外诱导培养后的增殖活性一致。IFN-γ能够激活记忆T细胞是机体预防细胞内病原菌再次感染的基础，它与IL-2的共表达对于抵抗病毒感染从而保护宿主特别重要[15-16]。而实验中淋巴细胞增殖，以及IFN-γ分泌，IL-2在加强免疫后4、6、8周均呈现上升趋势，且在8周时均持续在较高水平，说明BCG初免，IL-12作为基因佐剂连同Ag85A DNA疫苗加强的序贯免疫策略,可以产生特异性的Th1型反应,并且能维持较长而持续的记忆反应，对增强免疫原性的作用大于单独的BCG免疫和单纯使用BCG/DNA或BCG/IL-12的免疫方案。进而诱导更持久的细胞免疫应答，增强了BCG的免疫效果，产生比单纯BCG更有效的抗结核杆菌感染的保护作用。IL-4主要是一种Th2型反应的指标，虽然从免疫2周开始，BCG/Ag85A组的IL-4水平高于BCG组，Ag85A组(P<0.05)。且其IL-4明显高于BCG/IL-12组。但加强免疫后IL-4水平BCG/Ag85A+IL-12组在3个时间段均高于其它各组(P<0.05)。可这与IL-2相比，总体水平并不高，进一步说明这种联合免疫可强化细胞免疫反应，能够有效的激活小鼠体内的Th1型为主的免疫应答，产生较强的免疫原性。同时，对于诱导Th2型反应及抗体的产生作用较Th1型弱。但免疫效果的增加进一步说明了使用这种BCG初免，IL-12联合DNA加强的免疫方式优于BCG单独免疫以及BCG/Ag85DNA或BCG/IL-12联合的免疫方式，改善了传统BCG对机体细胞免疫的刺激作用,使得机体免疫反应向Th1型极化,诱导更明显和维持时间更长的细胞免疫应答。

实验证明,采用BCG初免，细胞因子IL-12作为基因佐剂联合DNA疫苗加强的序贯免疫策略,是对提高针对结核杆菌的疫苗免疫效应的一种新尝试。序贯免疫策略不仅能够增强细胞免疫应答同时将为耐受现有疫苗BCG的预防和治疗提供一条新的途径，也将会对人类在全世界范围内降低结核病的发病率和死亡率带来福音。

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