白术水提物对酵母朊病毒[PSI+]治愈作用的定量研究

李 辉，窦 爽，张 波，卜祥龙，钟正伟，宋有涛

细胞内正常的朊蛋白发生错误折叠后形成朊病毒，在人和其他哺乳动物体内引起多种致死性的传染性海绵状脑病(TSE)，包括疯牛病、羊瘙痒症(Scrapic)、人库鲁病(kuru)和人克雅氏病(CJD)等。神经元的广泛丢失以及脑切片呈现海绵状表型是这些疾病具有的共同特点[1]。朊病毒疾病因其高度传染性和致死性对整个社会造成了极大的危害[2]。由于朊病毒的分子致病机理的复杂性，迄今为止对朊病毒引起的疾病仍缺乏有效的治疗药物[3]。近年来研究者在动物、细胞和分子水平建立了一系列药物筛选模型来筛选治疗朊病毒疾病的候选药物，并研究发现了一些多糖类化合物、杂环化合物、抗生素类化合物和抗体等具有一定的抗朊病毒作用[4-5]。这些候选药物一般是成分明确的化合物或者是朊病毒抗体，而关于传统中药的抗朊病毒作用研究却鲜有报道。近年来研究显示在绿茶和姜黄提取物中存在具有抗朊病毒活性的成分，而且一些中药配方有治疗与朊病毒发病机制相似的帕金森和阿尔茨海默症的临床效果，这些都积极的暗示着在中药领域存在有抗朊病毒活性的物质[6-7]。

由于动物朊病毒细胞模型不具备明显的细胞表型，并且存在着与哺乳类动物内朊病毒交叉传染的危险性，使得实验成本昂贵、操作繁杂，严重限制了该领域的研究进展。研究证实，酿酒酵母中存在大约19种与朊病毒具有相似性质的蛋白类物质。这些朊病毒能够在体内和体外形成一些类淀粉性的纤维，在结构上与动物朊病毒的结构存在较大的相似性，能够发生构象转变[8-11]。同时酵母朊病毒有易检测的表型([PSI+]为白色，[psi-]为红色)。因此本文利用实验室改良的ΔERG6酵母朊病毒[PSI+]细胞模型，选取对帕金森病有一定疗效的菊科中药白术作为研究材料。

本研究使用的酵母细胞是一种ADE1基因由于位点特异性突变为非正常终止密码子而导致腺嘌呤生物合成被阻断的酵母细胞。一般情况下，酵母朊病毒[PSI+]是翻译终止因子Sup35p的淀粉样聚集形式。[PSI+]细胞中，Sup35p主要以聚集状态出现，使得ADE1基因进行正常翻译，无义突变抑制ade2-1突变株产生终止密码子通读现象，合成腺嘌呤，使[PSI+]细胞在腺嘌呤缺乏的SD培养基上生长为白色菌落；[psi-]细胞中的Sup35p呈单体状态，非无义抑制的ade2-1突变菌株需要在含有腺嘌呤的培养基上生长，细胞由于腺嘌呤代谢途径副产物累积，在培养基上生长菌落呈红色，不能在缺乏腺嘌呤的SD培养基上生长，这个颜色指示系统可以初步分析酵母朊病毒的存在状态[12]。基于颜色判定朊病毒状态的方法虽然直观、准确，仍然不能排除假阴性和假阳性实验结果的出现。因此我们引入半变性琼脂糖凝胶电泳(Semi Denaturing Deter gent Agarose Gel Electrophoresis，SDD-AGE)结合蛋白免疫技术在蛋白水平进一步验证[13-14]。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂 酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、琼脂粉均购自上海奥博星生物科技有限公司；尿嘧啶、色氨酸、亮氨酸均购自国药集团化学试剂有限公司；腺嘌呤购自美国Solarbio公司；盐酸胍(GuHCl)购自Sigma-Aldrich公司，ECL试剂购自碧云天生物有限公司。羊抗-Sup35抗体及驴抗羊二抗均购自上海西宝生物有限公司。

1.1.2菌株 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae:MATαkar1SUQ5ade2-1his3Δ202leu2Δ1trp1Δ63ura3-52erg6::KanMX，[PSI+]。将[PSI+]细胞划线于含有5 mmol/L盐酸胍的1 /2YPD固体平板上培养5 d后，分离红色单菌落得到[psi-]细胞。

1.1.3培养基 1/2YPD培养基：酵母浸粉0.5%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，固体平板加入2%琼脂。YPAD培养基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，腺嘌呤0.04%，固体平板加入2%琼脂。SD固体培养基：0.7%YNB-AA，2%葡萄糖，2%的琼脂粉(pH天然)。Ade：20 mg/L，Ura：20 mg/L，Trp：20 mg/L，Leu：60 mg/L。

1.1.4中药 白术购于沈阳东北大药房。

1.2方法

1.2.1白术水提物培养基的制备及酵母朊病毒[PSI+]遗传表型实验 将白术烘干后粉碎。称取10 g白术粉末，加入100 mL蒸馏水，95 ℃回流提取3 h，抽滤并回收滤液。用滤液配制1/2YPD液体培养基，灭菌后备用。[PSI+]酵母细胞在24 ℃过夜活化培养后，调整菌液光密度OD600为0.2左右，按10%接种量分别接种到含有白术水提物的1/2YPD液体培养体系，所有体系于24 ℃震荡培养5 d，每间隔24 h更换含有白术水提物的1/2YPD培养基。分别在1、3、5 d后取培养液稀释后涂布于1/ 2YPD 固体平板，平板于24 ℃ 培养7 d，观察菌落颜色变化，照相并统计阳性菌落(红色表型) 的比例。

1.2.2酵母菌落影印实验 随机挑取白术水提物治愈酵母朊病毒[PSI+]后的红色单菌落，分别影印到YPAD、SD-Ade和1/2YPD平板上。放置于24 ℃恒温培养箱，培养5 d后对平板进行记录。

1.2.3半变性琼脂糖凝胶电泳结合蛋白免疫技术 随机挑取白术水提物治愈酵母朊病毒[PSI+]后的红色单菌落活化，然后接种到YPD 液体培养基于30 ℃下培养约14～16 h ，测菌液OD600=1.5左右时停止培养，离心收集细胞，用珠磨仪裂解细胞，离心收集上清得到蛋白样品；然后采用SDD-AGE/Western blotting，首先进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在0 ℃、恒压0.35A 条件下转膜1 h，将蛋白转移到PVDF 膜上，一抗孵育1 h，4 ℃过夜后洗膜，二抗孵育1 h，洗膜后，采用ECL 发光试剂盒对其进行放射自显影检测，获得图像信息，记录并保存。

2 结 果

2.1白术水提物对酵母朊病毒[PSI+]的治愈作用 在含有白术水提物的1/2YPD液体培养基培养5 d，每间隔24 h更换含有白术水提物的1/2YPD培养基，涂板培养7 d后，可以明显看出白术水提物对酵母朊病毒[PSI+]有一定的治愈效果，治愈率为6%。从表型上看，白术水提物作用后的红色菌落初步被认为是治愈的[psi-]，白色菌落为未治愈的[PSI+]。

图1白术水提物对酵母朊病毒[PSI+]的治愈效果

Fig.1Effectsofaqueousextractsofrhizomaatractylodismacrocephalaeonyeast[PSI+]prion

Positive control of 5 mmol/L GuHCl cured [PSI+]cells; Negative control of [PSI+]cells.

图2 重复实验统计结果

2.2酵母菌落影印实验结果 挑取白术水提物作用酵母朊病毒[PSI+]5 d后出现的红色单菌落分别影印到含有腺嘌呤的培养基YPAD和缺乏腺嘌呤的培养基SD，如图所示，白色菌落和红色的菌落在YPAD生长的菌落颜色均为白色；只有白色菌落能在SD-Ade培养基上生长，而红色的菌落在SD-Ade培养基上基本不能生长，这是因为治愈后的[psi-]细胞不能合成腺嘌呤。

2.3半变性凝胶电泳结合蛋白免疫技术结果 酵母朊病毒[PSI+]和[psi-]的细胞中Sup35p以不同的结构状态存在。经过研究表明，在酵母朊病毒[PSI+]中Sup35p主要以聚集体形式存在，而在酵母朊病毒[psi-]中Sup35p以可溶性的单体形式存在。当Sup35p蛋白聚集后，会对于SDS产生一定的抗性，不可溶解，进而形成较大分子量的聚集体，反之，则为小分子量的单体。针对聚集体的分子量大小是反映酵母朊病毒[PSI+]聚集程度的重要指标，因此SDD-AGE/Western Blot技术，可以在蛋白水平检测细胞内朊病毒聚集体分子量的大小，进一步分析蛋白质水平内细胞内的具体形态，弥补颜色系统所带来的假阳性和假阴性的干扰，同时得出更加准确的结果。

图3影印培养法检测白术水提物作用效果

Fig.3Evaluationofthecuringeffectsofrhizomaatractylodismacrocephalaebyreplicaplating

结果显示，白术水提物作用酵母朊病毒[PSI+]后，细胞内Sup35p蛋白出现了聚集体、单体。且聚集体大小比[psi-]细胞内单体略大，但比[PSI+]细胞内的大聚集体略小。经过多次重复实验，这种大小比[psi-]细胞内单体略大，但比[PSI+]细胞内的大聚集体略小的聚集体出现比例较高，由此可知，白术水提物对酵母朊病毒[PSI+]有一定的治愈作用。

图4半变性凝胶电泳结合蛋白免疫技术检测白术水提物作用效果

Fig.4EvaluationofthecuringeffectsofrhizomaatractylodismacrocephalaebySemiDenaturingDetergentAgaroseGelElectrophoresiscombinedwithwesternblot

3 结 论

白术是一种菊科多年生草本植物，以根茎入药，有效成分有挥发性成分、内酯类成分、糖苷、多糖类成分以及氨基酸等。本实验室构建独有的抗酵母朊病毒药物筛选平台，已筛选出具有抗朊病毒活性的两面针、红花、枳实、烟草等中药。本文主要研究白术水提物对酵母朊病毒[PSI+]的治愈作用。结果表明，白术水提物对酵母朊病毒[PSI+]有一定的治愈作用，治愈率为6%。为了进一步验证其治愈效果，采用影印培养法和半变性凝胶电泳结合蛋白免疫技术在细胞和蛋白水平研究白术水提物对酵母朊病毒的治愈作用，结果表明，白术水提物作用酵母朊病毒[PSI+]细胞5 d 后出现的红色菌落中朊病毒的聚集状态有一些与[psi-]相同，另一些聚集体大小比[psi-]细胞内单体略大，但比[PSI+]细胞内的大聚集体略小，且这种聚集体所占比例较高。由此可知，白术水提物对酵母朊病毒[PSI+]有一定的治愈作用，这表明在中药领域存在着具有抗朊病毒活性的物质存在，同时对于研究和开发中药材抗哺乳动物朊病毒具有重要的意义。此外，本研究结果也显示蛋白水平采用的SDD-AGE/ Western blotting 技术和细胞水平采用的影印培养法在定量研究抗朊病毒候选药物的作用效果的重要性和可行性，丰富了Bach 等提出基于酵母细胞的抗朊病毒药物筛选模型的次级筛选分析方法，同时也为研究白术对酵母朊病毒[PSI+]治愈作用有效成分的分离纯化提供了科学依据。

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