酵母双杂交筛选与CVB3 VP3相互作用的人心脏蛋白

张志勤，赵颖洁，夏燕华，王 静，项国仕，邹叶青，黄孝天

柯萨奇病毒属于小RNA 病毒科肠道病毒属，它主要经粪-口途径传播，可引起包括心肌炎、脊髓炎、胰腺炎、手足口病等一系列疾病，甚至能引起新生儿的死亡[1-2]。1995年CVB3晶体结构解析显示，CVB3为无包膜的二十面体对称结构，VP1、VP2、VP3和VP4组成病毒衣壳，其中，VP1、VP2和VP3在病毒表面形成独特的峡谷样结构，这是病毒感染宿主细胞时与相应受体(如CAR)结合的位点。而VP3是CVB3重要的结构蛋白，具有高度的保守性和十分重要的功能，不仅对维持病毒的完整形态有重要作用,而且与病毒对心脏的亲和力密切相关[3]。目前对CVB3相关的研究主要集中于流行病学分析[2,4]、疫苗研究[5-7]及细胞表面受体研究[8-10]，而CVB3是如何导致细胞凋亡及持续性感染的机制尚未明确。本研究利用酵母双杂交筛选与病毒结构蛋白VP3相互作用的人心脏蛋白，为进一步研究VP3在CVB3致病中所发挥的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1质粒和菌株 DH5α由本室保存，酿酒酵母菌株AH109、pCL1、pGBKT7-Lam、pGBKT7-53、pTD1-1，预转化的人心脏cDNA文库、Y187、pGBKT7质粒、均购于Clontech公司。

1.2主要试剂 HiFi DNA polymerase(TransGen，北京)，限制性内切酶EcoR I和BamH I(TAKARA)、缺陷培养基试剂、酸化玻璃微珠购于Sigma公司，X-α-gal、鲑精DNA购于Clontech公司。

1.3诱饵质粒pGBKT7-VP3的构建 根据GenBank中柯萨奇B3病毒VP3基因cDNA序列(GI：323432)利用Primer 5.0设计一对包含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的引物：

F：5′CGGAATTCgagtacaatgggttacgttt3′

R：5′CGGGATCCtggaaaaagttttgctg3′

扩增片段为CVB3基因组中1 698～2 459 bp，包含VP3全长序列，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以病毒感染细胞逆转录cDNA为模板，PCR扩增VP3基因，将pGBKT7载体和PCR产物片段用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切，然后用T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜，转化至感受态细胞(DH5α)中，提取质粒后酶切鉴定，并对所得质粒进行DNA测序分析。

1.4BD-c-Myc-VP3融合蛋白表达检测 将AH109 [pGBKT7-VP3]菌落及阴性对照菌AH109[pGBKT7]菌落分别接种于SD/-Trp液体培养基中，30 ℃ 250 r/min振荡培养20 h，提取酵母蛋白，通过Western blot验证BD-c-Myc-VP3融合蛋白的表达。

1.5人心脏cDNA文库含量滴定 具体操作见文献[11-12]。

1.6酵母双杂交 将新鲜的AH109[pGBKT7-VP3]诱饵菌30 ℃振荡培养过夜，直至培养液中细胞浓度大于1.15×107cell/mL。按照Yeast protocols handbook(Clontech ，PT3024-1)中说明将诱饵菌AH109[pGBKT7-VP3]与人心脏cDNA文库菌Y187[pGADT7-cDNA Library]配合。

1.7阳性候选克隆初步分析

1.7.1阳性候选克隆归类与DNA序列分析 酚氯仿异戊醇法抽提阳性酵母菌中的质粒。以抽提的质粒DNA为模板，用pGADT7载体引物扩增cDNA中插入片段，并用AluI酶切PCR产物，根据1.0%琼脂糖凝胶电泳分析酶切带型并对阳性候选克隆进行归类，去掉重复的阳性候选克隆。将归类后的阳性候选克隆抽提pGADT7-ADx质粒，再电击转化至感受态细胞(DH5α)中，采用pGADT7载体通用引物对上述菌液进行测序。使用NCBI网站的BLAST程序对测序结果的同源性进行分析。

1.7.2阳性候选克隆自激活检测 乙酸锂法将上述鉴定后的pGADT7-ADx转入AH109感受态中，然后将候选克隆AH109[pGADT7-AD]、对照菌AH109[pGADT7](阴性对照)和AH109[pCL1](阳性对照)菌落接种至同一块SD/-Leu/X-α-Gal平板，30 ℃倒置培养1 d，观察菌落有无及颜色变化。

1.7.3回返配合 将筛选后的AD16、AD29、AD32、AD33、AD34、AD35、AD36、AD37、AD65、AD67文库质粒从Y187[pGADT7-AD]中抽提出来电击转化入AH109，再与Y187[pGBKT7-VP3]进行小规模配合试验，实验分组：①AH109[pGADT7-AD]×Y187[pGBKT7-VP3]，②AH109[pGBKT7]×Y187[pGADT7](阴性对照)③AH109[pGBKT7-53]×Y187[pTD1-1](阳性对照)。将回返配合中①组和③组生长的酵母克隆转种至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal平板上；将回返配合中②组铺于SD/-Trp/-Leu平板上培养3 d，再转种至SD/-Trp/-Leu/ X-α-Gal平板上(阴性对照)将以上转种后的菌培养1 d，观察菌落颜色变化。

1.8α-半乳糖苷酶活性定量分析 每种酵母双杂交阳性克隆均分二组配合后进行α-半乳糖苷酶定量分析:实验组和阴性对照组AH109[pGBKT7-VP3]×Y187[pGADT7-AD]和对照AH109[pGBKT7]×Y187[pGADT7-AD]另外，设立阳性对照组AH109[pGBKT7-53]×Y187[pTD1-1]，每组设立6个复孔，独立实验重复3次，OD410及OD600值均取3次实验均值。根据Lambert-Beer 定律,A=ε×b×c,制作标准曲线,求ε×b值,则ε×b 等于PNP在410 nm波长时的摩尔吸光度对浓度的标准曲线的斜率。α-半乳糖苷酶活性计算公式：α-半乳糖苷酶活性[milliunits/(mL(cell)]=OD410(Vf(1000/[(ε(b)(t(Vi(OD600]，其中，t=60 min，Vf=总体积200 μL，Vi=培养上清体积16 μL，OD600=菌悬液光密度值。

2 结 果

2.1pGBKT7-VP3质粒构建 PCR扩增VP3基因,对目的片段和pGBKT7同时EcoRI及BamHI酶切，经连接转化，挑取菌扩增后，再经抽取质粒经双酶切鉴定，片段大小762 bp相符(图1)。测序结果显示，碱基序列未发生突变，阅读框与载体匹配，表明质粒构建成功。

2.2BD-cMyc-VP3融合蛋白表达检测 将提取的相应酵母蛋白通过Western Blot检测蛋白的表达，利用c-Myc抗体检测BD-cMyc-VP3融合蛋白，在45 kDa处可以检测到特异性条带，表明含诱饵质粒的酵母菌成功表达融合蛋白(图2)。

2.3人心脏cDNA文库含量滴定 经滴定，人心脏cDNA文库菌Y187 菌落数为4.3×107cfu/ mL>1×106cfu/mL。据(clontech PT3247-1)中说明文库中独立的克隆数至少需要1×106cfu/mL才可有效筛出阳性克隆。

2.4阳性候选克隆归类及分析

2.4.1阳性候选克隆AluI酶切初步归类 从人心脏cDNA文库中筛选与VP3相互作用的基因，共获得阳性候选克隆50个。经过阳性酵母菌传代培养3次，无作用的pGADT7-AD质粒自然丢失。对酵母菌中pGADT7-AD质粒抽提，AluI酶切PCR产物对阳性克隆进行初步归类，分类标准是根据AluI酶切PCR产物片段带型，带型相同则归为一类，结果获得了10种不同类别的克隆(图3)。

2.4.2DNA序列测定和同源性分析 阳性候选克隆DNA测序由华大基因完成，将测序结果与NCBI GenBank数据库进行BLAST比对，共获得10个不同类别的基因：EIF4A2、HADHB、GAPDH、ASPG、ACTA1、TNNI3、CKM、LMOD3、ERGIC1、ALDH2(Table 1)，分别表达相应的蛋白。

2.4.3回返配合 将筛选出来的10种阳性克隆中pGADT7-AD质粒提出，转化至AH109，同时将pGBKT7-VP3转化至Y187，进行回返配合试验，10种克隆均显示蓝斑，进一步说明所筛选出来的蛋白与VP3存在相互作用(图4) 。

2.5α-半乳糖苷酶定量分析 如图5所见，10种阳性克隆的α-半乳糖苷酶定量分析表明：每种阳性克隆的两组配合试验菌中，AH109[pGBKT7-VP3]×Y187[pGADT7-ADx]的α-半乳糖苷酶活性均数和另一阴性对照组AH109[pGBKT7]×Y187[pGADT7-ADx]相比，差别均有统计学意义(P<0.01) ，同时也进一步证明了ADx与VP3均存在相互作用。

图1重组质粒酶切分析

Fig.1RestrictionanalysisofrecombinantplasmidpGBKT7-VP3

M1: Trans 2K DNA marker (Transgen);

M2: Trans 8K DNA marker (Transgen);

2: PCR Product of VP3;

3: Recombinant plasmids pGBKT7 digested byEcoR I andBamH I;

4: Recombinant plasmids pGBKT7-VP3 digested byEcoRI andBamHI.

图2DNA-BD-cMycVP3融合蛋白检测

Fig.2DetectionoffusionproteinBD-cMycVP3

Negative control: AH109 extract.

图3AluI酶切分类

Fig.3ClassificationbyAluIdigested

M: Trans 5K DNA marker (Transgen).

图4阳性候选克隆与CVB3VP3回返配合

Fig.4CandidatepositiveclonesinteractingwithCVB3VP3byre-hybrid

A: Experimental group colonies were significantly blue and positive control group colonies were light blue;

B: Negative control group was not displayed in blue.

1: AH109[pGADT7-AD16] ×Y187[pGBKT7-VP3];

2: AH109[pGADT7-AD29] ×Y187[pGBKT7-VP3];

3: AH109[pGADT7-AD32]×Y187[pGBKT7-VP3];

4: AH109[pGADT7-AD33]×Y187[pGBKT7-VP3];

5: AH109[pGADT7-AD34]×Y187[pGBKT7-VP3];

6: AH109[pGADT7-AD35]×Y187[pGBKT7-VP3];

7: AH109[pGADT7-AD36]×Y187[pGBKT7-VP3];

8: AH109[pGADT7-AD37]×Y187[pGBKT7-VP3];

9: AH109[pGADT7-AD65]×Y187[pGBKT7-VP3];

10: AH109[pGADT7-AD67]×Y187[pGBKT7-VP3];

+: AH109[pGBKT7-53]× Y187[pTD1-1] (positive control).

图5 10种阳性克隆的α-半乳糖苷酶定量分析

3 讨 论

随着酵母双杂交技术的普及，利用其研究蛋白与蛋白之间相互作用的报道也越来越多，Henke A等利用酵母双杂交筛选出与CVB3 VP2相互作用作用的前凋亡蛋白Siva后，Ulrike Martin等具体研究了CVB3 VP2是如何与siva作用从而导致细胞凋亡[13-14]。而关于CVB3 VP3蛋白相互作用的文献未见报道，本研究成功构建pGBKT7-VP3诱饵重组质粒，并证明了诱饵蛋白VP3对报告基因无激活作用且能够在酵母菌AH109中表达。经酵母双杂交大规模配合实验，从人心脏cDNA文库中筛选到10个与CVB3 VP3相互作用蛋白：真核翻译起始因子4A2(EIF4A2)、羟酰辅酶A脱氢酶三官能蛋白转录变体3(HADHB)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、门冬酰胺酶同系物(ASPG)、肌钙蛋白I3型(TNNI3)、骨骼肌α1肌动蛋白(ACTA1)、肌肉型肌酸激酶(CKM)、平滑肌蛋白3(LMOD3)、线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)、内质网-高尔基体中间室蛋白1(ERGIC1)。

EIF4A2作为一个高度保守的蛋白质合成的起始因子，与真核翻译起始因子4A1， EIF4A1)形成真核翻译起始因子4A(EIF4A)，EIF4A是一个RNA依赖的ATP酶/解旋酶，属于DEA(D/H)box蛋白超家族，参与mRNA结合到核糖体,同时也参与哺乳动物肌肉发育过程中的翻译调控[15-16]，有报道[17]称，在口蹄疫病毒感染的细胞中检测到EIF4A被病毒3C蛋白酶剪切，而这一现象对病毒来说是不利的，因为病毒的翻译也需要EIF4A，但他们观察到的仅仅是病毒3C蛋白酶剪切了一部分的EIF4A，可能对细胞整体的翻译机制影响不大。而CVB3感染细胞后如何与EIF4A或者其亚类EIF4A2作用的，是促进其病毒翻译还是抑制了病毒翻译还有待进一步的研究。

HADHB是线粒体三功能蛋白酶复合体的组成部分, 它与线粒体三功能蛋白酶复合体的另一个亚基HADHA 共同参与脂肪酸的氧化,催化线粒体β-氧化的长链脂肪酸的最后三个步骤，HADHB的缺陷，可进一步引起急性心衰[18-20]，这可能与少数病毒性心肌炎的患者进展为心衰存在一定的联系。

TNNI3属于肌钙蛋白家族，肌钙蛋白在肌肉伸缩装置中的细肌丝上与肌动蛋白和原肌球蛋白形成复合体，参与横纹肌功能，通过抑制肌球蛋白ATP酶活化[21]，从而抑制收缩。TNNI3在心肌细胞中特异表达，仅8%游离于细胞浆，在新生儿出生时表达上调，由于心脏收缩机制的重要性及TNNI3涉及心脏疾病，且其作为心脏主要的磷酸化蛋白，作用已被广泛研究，在临床上也被作为病毒性心肌炎诊断指标[22],同时也与家族性扩张型心肌病密切相关，具体为TNNI3基因的错义突变使得最大ATP酶效率降低，并且抑制Ca2+亲和性，从而引起扩张型心肌病的发生[23]。在CVB3感染引起的扩张型心肌病的过程中，会引起心肌细胞内Ca2 +改变从而引起细胞凋亡的发生[24]，那么，CVB3与TNNI3的相互作用是否使心肌炎进展呢？

表1 与CVB3 VP3相互作用的酵母双杂交阳性候选克隆分类

平滑肌蛋白3(LMOD3)属于LMOD，后者起到成核蛋白的作用，在心肌细胞中触发肌丝的形成。LMOD也能指导肌丝形成肌节，肌节在心脏中控制心肌的收缩。David Chereau等用RNAi技术来敲除心肌细胞LMOD之后，将导致心肌无法收缩[25-26]，这表明LMOD可能参与心肌疾病的进程。

线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)是存在于线粒体内的一种氧化乙醛的酶，能有效地应对内质网应激诱导的心肌超微结构、收缩及细胞内Ca2 +的异常改变，同时也能缓解细胞凋亡和自噬诱导[27]，而CVB3感染心肌细胞后会触发钙蛋白酶激活阻碍细胞的凋亡和自噬，从而促进子代病毒的复制[28]，这与ALDH2心肌保护的作用相同，CVB3是否通过ALDH2来作用于心肌细胞还有待考证。我们筛出的10个蛋白中有与心脏疾病的发生或发展有关，同时也有心肌保护蛋白，而在CVB3介导的心脏疾病过程中，这些蛋白到底承担着什么样的角色及具体的机制还未明确 ，这些蛋白的筛出给了我们进一步研究CVB3所致心肌炎机制一些提示，拓宽了我们的研究思路。

综上所述，本研究成功构建诱饵质粒pGBKT7-VP3,并从人心脏cDNA文库中获得的与CVB3 VP3相互作用的10个蛋白：EIF4A2、HADHB、GAPDH、ASPG、TNNI3、ACTA1、CKM、LMOD3、ALDH2、ERGIC1，并初步验证了他们与VP3的相互作用。此研究结果对于进一步深入研究CVB3 VP3功能具有重要的理论和指导意义，同时这也将为研究CVB3引起心肌炎和心肌疾病的分子致病机制提供了一些的新线索，但酵母双杂交可能出现假阳性，我们将使用免疫共沉淀及激光共聚焦等方法进行进一步确证CVB3 VP3与这些蛋白的相互作用。

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