高效液相色谱法测定尼可地尔中的有关物质
2014-03-31李步良黄东王昉
李步良 黄东 王昉
[摘要] 目的 建立尼可地尔中有关物质的测定方法。方法 碳十八烷键合硅胶（5μm）填充4mm×25cm不锈钢柱；流动相为水：四氢呋喃：三乙胺：三氟乙酸（982∶10∶5∶3）；检测波长：254nm；流速：调整流速使尼可地尔出峰时间约为18min。结果 尼可地尔与主要杂质能得到有效分离，各杂质在0.2～4.0μg/mL范围内呈良好线性关系。结论 本测定方法灵敏度高，准确可靠，可以控制尼可地尔中有关物质的含量。
[关键词] 尼可地尔；有关物质；系统适用性
[中图分类号] R917 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）02-52-03
尼可地尔（nicorandil），又名硝烟酯，化学名为N-（α-羟乙基）烟酰胺硝酸酯，是日本在1976年研制的烟酸类衍生物。它是一种钾通道激活剂，可以舒张动脉血管，同时又具有硝酸酯基结构，可以舒张静脉血管。目前，尼可地尔作为一种新型药物，在临床上广泛用于心绞痛、高血压等疾病的治疗中，增加冠脉血流量，不影响血压，心率及传导，用于治疗心绞痛，与硝酸酯一样，烟浪丁可激活细胞质鸟苷酸环化酶，从而导致细胞内环磷酸鸟苷升高和细胞内钙的降低，同时引起血管平滑肌松弛。
按照ICH指南Q2A、Q2B规定，要求为尼可地尔成品在出口放行及稳定性试验中有关物质的准确测定，提供合适的方法，目前普遍采用TLC方法来控制有关物质，但该方法适用性差，准确度不高，不能准确定量。参考文献[1-7]方法，本文采用高效液相色谱HPLC法建立了尼可地尔中有关物质的分析方法，并对该方法进行了验证，其回收率、线性、专属性、精密度、检测限和定量限等均满足要求，方法可行[1]。
1 仪器设备与试剂试药
HPLC高效液相色谱仪系统：沃特斯高效液相色谱仪2489检测器，2695分离单元（四元泵、717自动进样器、柱温箱）；软件：Empower3.工作站；HP1008打印机。
尼可地尔工作标准品（20100701）；四氢呋喃（色谱纯200808066，美国天地公司）；三乙胺（色谱纯08071，美国默克公司） 三氟乙酸（色谱纯09012，美国默克公司）尼可地尔酰化物工作对照品（lot：20100601，含量：99.0%中间体）；N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯（lot：20100602，含量：99.2%）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：C18（5μm）25mm×4mm。流速为1.0mL/min；检测波长为254nm。流动相：水：四氢呋喃：三乙胺：三氟乙酸（982∶10∶5∶3）；进样量：10μL。
2.2 溶液制备
供试品溶液：取20mg尼可地尔用流动相溶解并稀释至10.0mL容量瓶中作为样品溶液。取10μL样品溶液注入液相色谱仪。
系统适应性：灵敏度测试准确量取1mL供试品溶液，加入流动相制成50mL作为系统适应性溶液。吸取1mL系统适应性溶液，加入流动相准确制成20mL作为仪器灵敏度测试液，各取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，在灵敏度测试图谱中，尼可地尔峰面积约为系统适应性测试图谱中尼可地尔峰面积的2%～8%。
2.3 系统适应性试验
溶剂测试：取稀释溶剂10μL进样，作为溶剂空白，考察溶剂对杂质测定有无干扰，样品测定中溶剂空白产生的峰应忽略。
系统测试：取10mg N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯用流动相制成10mL，吸取1mL加入10mL样品溶液，按上述条件进行测试，N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯与尼可地尔分离度应不小于3.0。
系统重复性试验：取10μL系统适应性溶液，按上述条件测试连续进样6次。记录色谱图，按峰面积计算，尼可地尔峰面积相对平均偏差不超过1.5%。
2.4 方法的专属性测试
杂质及尼可地尔的分子结构确认（委托南京师范大学分析中心检测）：通过紫外分光光度计、液相色谱-质谱、红外分光光度计等方法进行结构解析确证各杂质的分子结构[2]。
已知单一杂质的定性：分别取尼可地尔酰化物（lot：20100601，含量：99.0%中间体） 10mg，至25mL的容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。进样，记录尼可地尔酰化物的保留时间，用保留时间对尼可地尔酰化物进行定性，N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯（lot：20100602，含量：99.2%）15mg，至25mL的容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。进样，记录N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯的保留时间，用保留时间对N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯进行定性，各杂质的分离度和理论板数都符合规定，见图1。
2.5 强制降解实验
分别精密称取尼可地尔样品细粉20mg分别置于20mL容量瓶中，共5份，分别在强酸1、2、3、5h，强碱1、2、3、5h，强氧化1、2、3、5h，高温、光照1、3、5、10d等条件进行强制降解实验，用溶剂稀释至刻度，即得1.0mg/mL的溶液，以上样品分别用液相色谱仪进样测定，由色谱图可看出各破坏条件下的降解产物与尼可地尔主成分峰均有良好的分离[3]。
2.6 进样重复性和精密度
取标准溶液连续重复6次进样，按峰面积计算，在重复性和中间精密度测试项下，各组分峰面积的相对偏差均小于2.0%；重复性和中间精密度两者之间没有显著性差异。中间精密度和重复性均符合规定。
2.7 尼可地尔及杂质的线性回归试验
标准贮备液：分别精密称取以下标准品：尼可地尔酰化物工作对照品（lot：20100601，含量：99.0%中间体）；N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯（lot：20100602，含量：99.2%）和尼可地尔10mg，各至一个50mL容量瓶中，分别加入溶剂超声溶解并稀释至刻度，混合均匀。在分别取5～50mL得每个已知组分的浓度均约为20μg/mL。
精密量取有关物质对照品的贮备液0.5、1、2.5、4、5、6、10mL分别至8个50mL容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，制成浓度分别为0.2、0.4、1.0、1.6、2.0、2.4、4.0μg/mL的一系列溶液，摇匀，各精密量取10μL，注入液相色谱仪。记录各浓度的色谱峰面积，以峰面积A对浓度C （μg/mL） 进行线性回归，得尼可地尔的有关物质的回归方程分别为：A=42196.3C-128.1， r=0.9995；A=38042.01C+1026.01， r=0.9990。结果表明有关物质Ⅰ及有关物质Ⅱ在0.2～4.0μg/mL的范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.8 加样回收试验
精密称取已测定有关物质含量的样品适量，共3份，分别置100mL棕色容量瓶中，加适量溶剂溶解，然后各精密加入有关物质对照品的贮备液1.6、2.0和2.4mL，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，按“样品有关物质测定”项下的方法分别测定有关物质的含量，减去样品本底，计算回收率，结果测得的平均回收率分别为：尼可地尔酰化物为99.5%，RSD=0.93%（n=9）；N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯为98.6%， RSD=1.1%（n=9）。
2.9 尼可地尔杂质检测限、定量限的测定
在选定的色谱条件下，按信噪比为3对最低检测限进行测定，结果表明：尼可地尔酰化物的浓度为5.20×103μg/mL，进样量为10μL时，最低检测限量为0.2ng。N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯的浓度为1.53×103μg/mL，进样量为10μL时，最低检测限量为0.5ng。按信噪比为10对最低定量限进行测定，结果表明尼可地尔酰化物的浓度为1.52×102μg/mL，进样量为10μL时，最低定量限量为0.5ng。N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯的浓度为4.55×102μg/mL，进样量为10μL时，最低定量限量为0.9ng。其他未知杂质的检测限和定量限以尼可地尔来进行评价，依次为0.05ng和0.01ng。
2.10 尼可地尔样品溶液的稳定性测试
取尼可地尔1.0mg/mL样品溶液存放在冷处分别于0、4、8、12、24和48h进样测定。记录有关物质的峰面积，并用归一化法考察有关物质的含量，结果有关物质含量与初始溶液相比无明显变化，RSD为1.0%，而且没有降解产物出现，结果表明，在冷处条件下，样品溶液在48h内可保持稳定[6]。
2.11 尼可地尔样品中有关物质测定（表1）
取样品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，记录色谱图至主成分保留时间的2.5倍。按面积归一化法计算单一杂质及总杂质的含量，尼可地尔样品杂质含量测定结果符合欧洲药典European Pharmacopoeia Commission. European Pharmacopoeia[S]，7.0.ed 规定[7]。
3 讨论
试用日常检验常用的色谱柱Hypersil ODS C18柱及Diamonsil C18柱Purospher C18柱进行测定均可获得满意的结果， 说明本法对色谱柱没有一定的选择性。
取尼可地尔工作标准品、尼可地尔酰化物工作对照品；N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯用溶剂溶解稀释制成溶液，在200～400nm波长扫描，尼可地尔在254nm处有最大吸收，尼可地尔酰化物在262nm处有最大吸收；N-（2-羟基乙基）异烟碱在273nm处有最大吸收，在254nm处两个杂质均有较大吸收，所以选择254nm作为本品有关物质的检测波长[8]。
实验结果表明，采用HPLC高效液相色谱法来检查尼可地尔中的有关物质，尼可地尔中的主成分、各中间体和分解产物均能达到较好的分离，该方法简便实用方法可以满足尼可地尔药物的杂质控制和稳定性研究有一定的参考意义[9]。
[参考文献]
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部） [S].北京：化学工业出版社，2005.
[2] 阎平，谢剑炜.高效液相色谱法测定盐酸噻吩诺啡有关物质的方法研究[J].分析试验室，2006，25（12）：8-10.
[3] 王建，洪利娅，倪坤仪.液相色谱-蒸发光散射-电喷雾离子阱质谱法测定硫酸异帕米星及其有关物质[J].分析化学， 2006，34（9）：19-22.
[4] 黄东.高效液相色谱法测定氟他胺中有关物质[J].药学与临床研究，2007，15（6）：452-455.
[5] 黄春森，黄东，李步良.高效液相色谱法测定苯扎贝特中的有关物质[J].中国医疗前沿，2008，3（16）：99-100.
[6] 李宁，刘宇，宫平，等.CD-01盐酸盐中有关物质的HPLC法检测及稳定性考察[J].沈阳药科大学学报，2005，22（6）：429-432.
[7] European Pharmacopoeia Commission.European pharmacopoeia[S].5 ed.EDQM，2005.
[8] 李明华，阮朝滨，陈雨，等.HPLC法测定盐酸氨溴索片的有关物质[J].医药前沿，2012，34（31）：151-153.
[9] 王守箐.HPLC测定枸橼酸莫沙必利片的有关物质[J].药物分析杂志，2011，31（12）：2330-2332.
（收稿日期：2013-11-07）
精密量取有关物质对照品的贮备液0.5、1、2.5、4、5、6、10mL分别至8个50mL容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，制成浓度分别为0.2、0.4、1.0、1.6、2.0、2.4、4.0μg/mL的一系列溶液，摇匀，各精密量取10μL，注入液相色谱仪。记录各浓度的色谱峰面积，以峰面积A对浓度C （μg/mL） 进行线性回归，得尼可地尔的有关物质的回归方程分别为：A=42196.3C-128.1， r=0.9995；A=38042.01C+1026.01， r=0.9990。结果表明有关物质Ⅰ及有关物质Ⅱ在0.2～4.0μg/mL的范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.8 加样回收试验
精密称取已测定有关物质含量的样品适量，共3份，分别置100mL棕色容量瓶中，加适量溶剂溶解，然后各精密加入有关物质对照品的贮备液1.6、2.0和2.4mL，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，按“样品有关物质测定”项下的方法分别测定有关物质的含量，减去样品本底，计算回收率，结果测得的平均回收率分别为：尼可地尔酰化物为99.5%，RSD=0.93%（n=9）；N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯为98.6%， RSD=1.1%（n=9）。
2.9 尼可地尔杂质检测限、定量限的测定
在选定的色谱条件下，按信噪比为3对最低检测限进行测定，结果表明：尼可地尔酰化物的浓度为5.20×103μg/mL，进样量为10μL时，最低检测限量为0.2ng。N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯的浓度为1.53×103μg/mL，进样量为10μL时，最低检测限量为0.5ng。按信噪比为10对最低定量限进行测定，结果表明尼可地尔酰化物的浓度为1.52×102μg/mL，进样量为10μL时，最低定量限量为0.5ng。N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯的浓度为4.55×102μg/mL，进样量为10μL时，最低定量限量为0.9ng。其他未知杂质的检测限和定量限以尼可地尔来进行评价，依次为0.05ng和0.01ng。
2.10 尼可地尔样品溶液的稳定性测试
取尼可地尔1.0mg/mL样品溶液存放在冷处分别于0、4、8、12、24和48h进样测定。记录有关物质的峰面积，并用归一化法考察有关物质的含量，结果有关物质含量与初始溶液相比无明显变化，RSD为1.0%，而且没有降解产物出现，结果表明，在冷处条件下，样品溶液在48h内可保持稳定[6]。
2.11 尼可地尔样品中有关物质测定（表1）
取样品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，记录色谱图至主成分保留时间的2.5倍。按面积归一化法计算单一杂质及总杂质的含量，尼可地尔样品杂质含量测定结果符合欧洲药典European Pharmacopoeia Commission. European Pharmacopoeia[S]，7.0.ed 规定[7]。
3 讨论
试用日常检验常用的色谱柱Hypersil ODS C18柱及Diamonsil C18柱Purospher C18柱进行测定均可获得满意的结果， 说明本法对色谱柱没有一定的选择性。
取尼可地尔工作标准品、尼可地尔酰化物工作对照品；N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯用溶剂溶解稀释制成溶液，在200～400nm波长扫描，尼可地尔在254nm处有最大吸收，尼可地尔酰化物在262nm处有最大吸收；N-（2-羟基乙基）异烟碱在273nm处有最大吸收，在254nm处两个杂质均有较大吸收，所以选择254nm作为本品有关物质的检测波长[8]。
实验结果表明，采用HPLC高效液相色谱法来检查尼可地尔中的有关物质，尼可地尔中的主成分、各中间体和分解产物均能达到较好的分离，该方法简便实用方法可以满足尼可地尔药物的杂质控制和稳定性研究有一定的参考意义[9]。
[参考文献]
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部） [S].北京：化学工业出版社，2005.
[2] 阎平，谢剑炜.高效液相色谱法测定盐酸噻吩诺啡有关物质的方法研究[J].分析试验室，2006，25（12）：8-10.
[3] 王建，洪利娅，倪坤仪.液相色谱-蒸发光散射-电喷雾离子阱质谱法测定硫酸异帕米星及其有关物质[J].分析化学， 2006，34（9）：19-22.
[4] 黄东.高效液相色谱法测定氟他胺中有关物质[J].药学与临床研究，2007，15（6）：452-455.
[5] 黄春森，黄东，李步良.高效液相色谱法测定苯扎贝特中的有关物质[J].中国医疗前沿，2008，3（16）：99-100.
[6] 李宁，刘宇，宫平，等.CD-01盐酸盐中有关物质的HPLC法检测及稳定性考察[J].沈阳药科大学学报，2005，22（6）：429-432.
[7] European Pharmacopoeia Commission.European pharmacopoeia[S].5 ed.EDQM，2005.
[8] 李明华，阮朝滨，陈雨，等.HPLC法测定盐酸氨溴索片的有关物质[J].医药前沿，2012，34（31）：151-153.
[9] 王守箐.HPLC测定枸橼酸莫沙必利片的有关物质[J].药物分析杂志，2011，31（12）：2330-2332.
（收稿日期：2013-11-07）
精密量取有关物质对照品的贮备液0.5、1、2.5、4、5、6、10mL分别至8个50mL容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，制成浓度分别为0.2、0.4、1.0、1.6、2.0、2.4、4.0μg/mL的一系列溶液，摇匀，各精密量取10μL，注入液相色谱仪。记录各浓度的色谱峰面积，以峰面积A对浓度C （μg/mL） 进行线性回归，得尼可地尔的有关物质的回归方程分别为：A=42196.3C-128.1， r=0.9995；A=38042.01C+1026.01， r=0.9990。结果表明有关物质Ⅰ及有关物质Ⅱ在0.2～4.0μg/mL的范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.8 加样回收试验
精密称取已测定有关物质含量的样品适量，共3份，分别置100mL棕色容量瓶中，加适量溶剂溶解，然后各精密加入有关物质对照品的贮备液1.6、2.0和2.4mL，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，按“样品有关物质测定”项下的方法分别测定有关物质的含量，减去样品本底，计算回收率，结果测得的平均回收率分别为：尼可地尔酰化物为99.5%，RSD=0.93%（n=9）；N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯为98.6%， RSD=1.1%（n=9）。
2.9 尼可地尔杂质检测限、定量限的测定
在选定的色谱条件下，按信噪比为3对最低检测限进行测定，结果表明：尼可地尔酰化物的浓度为5.20×103μg/mL，进样量为10μL时，最低检测限量为0.2ng。N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯的浓度为1.53×103μg/mL，进样量为10μL时，最低检测限量为0.5ng。按信噪比为10对最低定量限进行测定，结果表明尼可地尔酰化物的浓度为1.52×102μg/mL，进样量为10μL时，最低定量限量为0.5ng。N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯的浓度为4.55×102μg/mL，进样量为10μL时，最低定量限量为0.9ng。其他未知杂质的检测限和定量限以尼可地尔来进行评价，依次为0.05ng和0.01ng。
2.10 尼可地尔样品溶液的稳定性测试
取尼可地尔1.0mg/mL样品溶液存放在冷处分别于0、4、8、12、24和48h进样测定。记录有关物质的峰面积，并用归一化法考察有关物质的含量，结果有关物质含量与初始溶液相比无明显变化，RSD为1.0%，而且没有降解产物出现，结果表明，在冷处条件下，样品溶液在48h内可保持稳定[6]。
2.11 尼可地尔样品中有关物质测定（表1）
取样品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，记录色谱图至主成分保留时间的2.5倍。按面积归一化法计算单一杂质及总杂质的含量，尼可地尔样品杂质含量测定结果符合欧洲药典European Pharmacopoeia Commission. European Pharmacopoeia[S]，7.0.ed 规定[7]。
3 讨论
试用日常检验常用的色谱柱Hypersil ODS C18柱及Diamonsil C18柱Purospher C18柱进行测定均可获得满意的结果， 说明本法对色谱柱没有一定的选择性。
取尼可地尔工作标准品、尼可地尔酰化物工作对照品；N-（2-羟基乙基）异烟碱硝酸酯用溶剂溶解稀释制成溶液，在200～400nm波长扫描，尼可地尔在254nm处有最大吸收，尼可地尔酰化物在262nm处有最大吸收；N-（2-羟基乙基）异烟碱在273nm处有最大吸收，在254nm处两个杂质均有较大吸收，所以选择254nm作为本品有关物质的检测波长[8]。
实验结果表明，采用HPLC高效液相色谱法来检查尼可地尔中的有关物质，尼可地尔中的主成分、各中间体和分解产物均能达到较好的分离，该方法简便实用方法可以满足尼可地尔药物的杂质控制和稳定性研究有一定的参考意义[9]。
[参考文献]
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部） [S].北京：化学工业出版社，2005.
[2] 阎平，谢剑炜.高效液相色谱法测定盐酸噻吩诺啡有关物质的方法研究[J].分析试验室，2006，25（12）：8-10.
[3] 王建，洪利娅，倪坤仪.液相色谱-蒸发光散射-电喷雾离子阱质谱法测定硫酸异帕米星及其有关物质[J].分析化学， 2006，34（9）：19-22.
[4] 黄东.高效液相色谱法测定氟他胺中有关物质[J].药学与临床研究，2007，15（6）：452-455.
[5] 黄春森，黄东，李步良.高效液相色谱法测定苯扎贝特中的有关物质[J].中国医疗前沿，2008，3（16）：99-100.
[6] 李宁，刘宇，宫平，等.CD-01盐酸盐中有关物质的HPLC法检测及稳定性考察[J].沈阳药科大学学报，2005，22（6）：429-432.
[7] European Pharmacopoeia Commission.European pharmacopoeia[S].5 ed.EDQM，2005.
[8] 李明华，阮朝滨，陈雨，等.HPLC法测定盐酸氨溴索片的有关物质[J].医药前沿，2012，34（31）：151-153.
[9] 王守箐.HPLC测定枸橼酸莫沙必利片的有关物质[J].药物分析杂志，2011，31（12）：2330-2332.
（收稿日期：2013-11-07）
