市售鹿鞭的DNA指纹鉴定研究

刘洋　张丽华

[摘要] 目的 探讨鹿鞭及牛鞭线粒体细胞色素b基因（Cytb）部分序列片段特征，建立中药材鹿鞭敏感、特异的DNA分子标记学鉴定方法。方法 对市售鹿鞭进行样本处理，模板制备，采用鹿鞭特异性引物进行PCR反应，对市售鹿鞭样本采取DNA指纹鉴定。结果 对市售鹿鞭中药材进行mtDNA鉴定，有三个样本为正品。结论 此方法对市售鹿鞭鉴定，可准确辨别正品与伪品。重现性、稳定性好，简便准确而可行，说明鹿鞭mtDNA具有特异性指纹特征，所得鹿鞭DNA指纹特征图谱可用于市售鹿鞭的鉴定。

[关键词] 市售鹿鞭；线粒体DNA；DNA指纹鉴定

[中图分类号] R282.5 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）02-50-03

20世纪80年代，由于分子分类学的出现，使人们从研究生物形态表征进入到生物的DNA遗传物质。人们可以根据DNA系列的差异来鉴定生物物种，是因为同种生物体有相同的DNA系列，不同种生物有不同DNA系列。除了矿物类药材外大多数药材是从动植物中得到，动植物药材一般从死亡的干燥生物或者其组织器官中来。随着生物体的逐渐死亡，DNA会被核酸酶大量降解，使药材中DNA的分析有一定难度。近些年，分子生物学发展速度很快，尤其是微量DNA提取技术与PCR扩增技术，使从药材中提取分析微量的DNA成为可能，也为药材进行DNA技术鉴定提供了可能。DNA分析技术使中药材和与其容易混淆品种之间如何更好地鉴定找到了一个好办法。mtDNA是遗传信息的载体，它被认为是动物起源进化的研究和分析群体遗传的最佳对象，Cytb进化速度适中，是分析种内、种间遗传多样性和进化关系的适当的DNA片段，可以应用于生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究 。本研究旨在探索将DNA指纹鉴定技术应用于市售鹿鞭鉴定中，以此提高其鉴定准确性[1]。

1 材料与仪器

1.1 一般材料

1.1.1 样本 市售的鹿鞭由吉林市参茸市场随机购买，共2批，抽取6个样本，编号为：1、2、3、4、5、6。干品牛鞭样本，编号为7。鹿鞭及其伪充药材均经吉林市食品药品检验所鉴定。

1.1.2 酶及DNA分子量标准 Taq酶：购自北京鼎国公司，λDNA/HindⅢ：购自TIANGEN公司，DNA MarkerⅠ：购自TIANGEN公司。

1.1.3 主要化学试剂 琼脂糖：购England，dNTP及PCR缓冲液：购自北京置鼎国公司，其他常用化学试剂：国产或进口分析纯。

1.2 主要仪器设备

TGL-16G台式高速离心机：上海医用分析仪器厂，H-2050R型台式低温高速离心机：美国Becman公司。

2 方法

2.1 样本的前处理

将市售鹿鞭中药材6个样本及干品牛鞭的龟头及阴茎部分，用粉碎机粉碎处理，将粉碎后的干燥纤维置于4℃保存，备用。

2.2 模板的制备

取粉碎后的市售鹿鞭6个样本及干品牛鞭1个样本各1.0g，彻底清洗后紫外照射30min，分别转入25mL离心管中，加入10倍左右的0.5mol/L EDTA（pH 8.0），56℃保温72h。4000rpm 4℃离心15min，倒掉上清液。加入裂解液5mL，56℃水浴中保温过夜，至组织完全消化溶解。消化液用等体积饱和酚抽提1次，等体积酚-氯仿抽提2次，氯仿-异戊醇（24∶1）抽提1次。加入2倍体积的-20℃的无水乙醇，混匀放于冰箱中过夜。15000rpm 4℃离心30min，真空干燥，溶解于TE缓冲液。

2.3 聚合酶链式反应

以提取的市售鹿鞭和干品牛鞭mtDNA为模板，灭菌双蒸水作为阴性对照进行PCR。反应体系30μL，在0.5mL PCR反应管中依次加入10×PCR buffer 5μL，1.25mmol/L dNTP 4μL，10pmol/L引物1和引物2各2.0μL，Taq DNA聚合酶（1U）1μL，模板2μL，双蒸水补至30μL（总反应体系为30?L）。反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环后于72℃延伸5min[2]。

2.4 电泳鉴定

将PCR产物各取6?L，加2?L 6×loading Buffer，混匀后点样于2%琼脂糖凝胶中，DNA MarkerⅠ为参照，60V，30min，成像并拍照。

3 结果

4 讨论

线粒体DNA基因组的优点很多，比如分子结构简单、严格的母系遗传、无重组、与核DNA基因组无共同序列、多拷贝、进化速率快、分子钟理论等，和核DNA相比更容易检测，亲缘关系相关或相近的物种都能得到区分和鉴定。采用mtDNA作为分子标记的研究工作已被广泛地展开，而且比同等长度的核DNA基因研究更为深入。现在常用的分子标记物有Cytb基因、16SrRNA基因、12S rRNA基因、Co基因、D-loop 控制区、NP基因等，其间Cytb基因由于其独具的优势而广泛研究应用。Cytb起源很古老，发现于许多原核生物的细胞和几乎所有的真核生物中。它不仅在属间、种间存在多样性，而且在品种内、品种间个体间都存在多样性。所以对阐明生物间的亲缘关系和物种鉴定方面都具有极其重要的意义[3]。Cytb基因和其余线粒体基因比较，进化速度适中，容易被一些通用引物扩增和测序，从结构和功能方面看也是当前研究最为清楚的基因之一，常用作科以上分类单位和种间的进化研究。Cytb基因是线粒体功能区，在物种进化研究中，线粒体功能区的序列测定作为重要依据得到广泛应用。在进化过程中，基因序列变异率相对较高，种间差异较大，是当今脊椎动物中被测序得最广泛的基因。Cytb基因是研究种间进化关系最好的基因，越来越广泛地应用，有可能成为分类学的标准片段，在物种鉴定中可将Cytb基因检测作为一种重要的手段。

在实验操作中，我们应从反应的模板DNA浓度、反应体系中dNTP浓度、Mg2+浓度、Taq酶用量以及引物的选择这几方面进行反复摸索，找到反应的最佳条件，使反应后的扩增产物具有高度重复性。在进行鉴定前，应将药材进行彻底清洗后紫外照射30min，避免结果失真。

鉴定市售鹿鞭所用的特异性引物，是选择了正品鹿鞭和牛鞭有显著差异的一段Cyb基因序列，而正品鹿鞭和牛鞭的基因序列均来自GenBank中正品鹿鞭和牛鞭的基因序列，此引物在新鲜品鹿鞭与牛鞭鉴定中曾使用，新鲜品鹿鞭扩增出306bp基因片段，而牛鞭未扩增出相同的基因片段[4-6]。本实验采用此鹿鞭特异性引物对市售鹿鞭进行的DNA指纹鉴定，与新鲜品鹿鞭和牛鞭鉴定结果一致，和吉林省吉林市食品药品检验所的鉴定结果相符。该结果表明：本课题组设计的特异性鉴别引物，可以用于市售鹿鞭与伪品的鉴别。从研究的结果来看，将分子生物学技术引入到动物类药材的鉴定中是可行的，说明用以上技术鉴定动物类药材的有效性和可靠性[7-8]。

[参考文献]

[1] 张丽华，李明成，王冰梅，等.貂心线粒体mtDNA鉴定及特征分析[J].中国药学杂志，2008，43（22）：1694-1696.

[2] 刘洋，张丽华，薄艳，等.鹿鞭线粒体DNA指纹鉴定[J].中国医药科学，2011，19（2）：30-31.

[3] 李慧珍，李水福.鹿鞭的真伪优劣鉴定[J].中国药业，2008，17（10）：66-69.

[4] 张丽华，李明成，王冰梅.貂组织线粒体DNA及细胞色素b鉴定及特征[J].吉林大学学报（医学版），2008，34（5）：790-793.

[5] Zhang Li-hua，Yang Ming-yan，Wang Bing-mei，et al.Application of molecular biology Techniques on the Identification of Martes zibellina L.Hearts and its Counterfeits[C].CNPTM，2009：448-451.

[6] 刘洋，杨明妍，张丽华，等.梅花鹿鞭与伪品牛鞭细胞色素bDNA指纹鉴定[J].时珍国医国药，2010，184（21）：3274-3275.

[7] Crimi M ，Rigolio R.The mitochondrial genome ，a growing interest inside an organelle[J].Int J Nanomedicine，2008，3（1）：51-57.

[8] 刘洋，张丽华，薄艳，等.鹿鞭线粒体DNA指纹鉴定[J].中国医药科学，2011，19（1）：112-113.

（收稿日期：2013-10-12）

在实验操作中，我们应从反应的模板DNA浓度、反应体系中dNTP浓度、Mg2+浓度、Taq酶用量以及引物的选择这几方面进行反复摸索，找到反应的最佳条件，使反应后的扩增产物具有高度重复性。在进行鉴定前，应将药材进行彻底清洗后紫外照射30min，避免结果失真。

鉴定市售鹿鞭所用的特异性引物，是选择了正品鹿鞭和牛鞭有显著差异的一段Cyb基因序列，而正品鹿鞭和牛鞭的基因序列均来自GenBank中正品鹿鞭和牛鞭的基因序列，此引物在新鲜品鹿鞭与牛鞭鉴定中曾使用，新鲜品鹿鞭扩增出306bp基因片段，而牛鞭未扩增出相同的基因片段[4-6]。本实验采用此鹿鞭特异性引物对市售鹿鞭进行的DNA指纹鉴定，与新鲜品鹿鞭和牛鞭鉴定结果一致，和吉林省吉林市食品药品检验所的鉴定结果相符。该结果表明：本课题组设计的特异性鉴别引物，可以用于市售鹿鞭与伪品的鉴别。从研究的结果来看，将分子生物学技术引入到动物类药材的鉴定中是可行的，说明用以上技术鉴定动物类药材的有效性和可靠性[7-8]。

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[6] 刘洋，杨明妍，张丽华，等.梅花鹿鞭与伪品牛鞭细胞色素bDNA指纹鉴定[J].时珍国医国药，2010，184（21）：3274-3275.

[7] Crimi M ，Rigolio R.The mitochondrial genome ，a growing interest inside an organelle[J].Int J Nanomedicine，2008，3（1）：51-57.

[8] 刘洋，张丽华，薄艳，等.鹿鞭线粒体DNA指纹鉴定[J].中国医药科学，2011，19（1）：112-113.

（收稿日期：2013-10-12）

在实验操作中，我们应从反应的模板DNA浓度、反应体系中dNTP浓度、Mg2+浓度、Taq酶用量以及引物的选择这几方面进行反复摸索，找到反应的最佳条件，使反应后的扩增产物具有高度重复性。在进行鉴定前，应将药材进行彻底清洗后紫外照射30min，避免结果失真。

鉴定市售鹿鞭所用的特异性引物，是选择了正品鹿鞭和牛鞭有显著差异的一段Cyb基因序列，而正品鹿鞭和牛鞭的基因序列均来自GenBank中正品鹿鞭和牛鞭的基因序列，此引物在新鲜品鹿鞭与牛鞭鉴定中曾使用，新鲜品鹿鞭扩增出306bp基因片段，而牛鞭未扩增出相同的基因片段[4-6]。本实验采用此鹿鞭特异性引物对市售鹿鞭进行的DNA指纹鉴定，与新鲜品鹿鞭和牛鞭鉴定结果一致，和吉林省吉林市食品药品检验所的鉴定结果相符。该结果表明：本课题组设计的特异性鉴别引物，可以用于市售鹿鞭与伪品的鉴别。从研究的结果来看，将分子生物学技术引入到动物类药材的鉴定中是可行的，说明用以上技术鉴定动物类药材的有效性和可靠性[7-8]。

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[5] Zhang Li-hua，Yang Ming-yan，Wang Bing-mei，et al.Application of molecular biology Techniques on the Identification of Martes zibellina L.Hearts and its Counterfeits[C].CNPTM，2009：448-451.

[6] 刘洋，杨明妍，张丽华，等.梅花鹿鞭与伪品牛鞭细胞色素bDNA指纹鉴定[J].时珍国医国药，2010，184（21）：3274-3275.

[7] Crimi M ，Rigolio R.The mitochondrial genome ，a growing interest inside an organelle[J].Int J Nanomedicine，2008，3（1）：51-57.

[8] 刘洋，张丽华，薄艳，等.鹿鞭线粒体DNA指纹鉴定[J].中国医药科学，2011，19（1）：112-113.

（收稿日期：2013-10-12）