鳄鱼资源开发和生物活性物质研究进展

李海航，罗嘉玲，倪 贺

(华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广州510631)

鳄鱼属脊索动物门、脊椎动物亚门、爬行纲、鳄目，共有3科 (鳄科 Crocodylidae、长吻鳄科或食鱼鳄科 Gavialidae、鼍科或短吻鳄科 Alligatoridae)8属，世界上尚存23种．除我国的扬子鳄和北美洲的密西西比鳄生活在温带外，其他鳄鱼都分布于热带和亚热带地区．鳄鱼为肉食性卵生脊椎类两栖爬行动物，是两亿多年前与恐龙同时代的最古老两栖爬行动物，也是迄今生存着的最原始动物之一．鳄鱼因强盛的生命力而生存和繁衍至今，成为地球上最古老的生物“活化石”之一．鳄鱼属于濒危野生保护动物，被国际上列为I类保护的濒危野生动植物．我国特产的扬子鳄 (亦称中华鳄Alligator sinensis)被列为国家一级野生保护动物．2003年国家林业局批准了尼罗鳄(Crocodylus niloticus)、湾鳄 (C．porosus)和暹罗鳄(俗称泰国鳄，C．siamensis)等3种鳄鱼列入首批54种可商业利用的野生动物［1］．

鳄鱼全身都是宝，鳄鱼皮可制作高级皮革、鳄鱼肉有很高的营养价值和保健功能，鳄鱼的其他组织器官也都有不同的医药保健功能和开发利用价值．我国古代的《本草纲目》记载，鳄鱼为“土龙”，“主治心腹症瘕、湿气邪气”．我国和一些东南亚国家自古有食用鳄鱼肉治疗咳嗽哮喘的传统．鳄鱼自身超强的免疫能力和抗病与逆境能力，引起了生物医学界的广泛兴趣．鳄作为最古老的动物之一，也是研究生物进化、繁衍濒危动物和保护生态环境等的重要材料．鳄鱼的高经济价值和重要的医学与生物学研究价值，受到养殖业和学术界的广泛重视．我国从1993年开始引进外来鳄种和大量养殖，逐渐成为主要的鳄鱼养殖、加工和消费国之一．鳄鱼血等各组织器官的抗菌和抗病毒及其活性成分等研究取得了重要的进展．美国和澳大利亚等地的科学家成立了国际鳄鱼基因组工作组(The International Crocodilian Genomes Working Group，ICGWG，http://crocgenomes．org)，研究测定美洲鳄、湾鳄和印度鳄(Gavialis gangeticus)3种鳄鱼的全基因组序列［2］．本文主要介绍近年来在鳄鱼养殖和鳄鱼生物活性及其活性成分方面的研究进展．

1 鳄鱼血的功能与活性成分研究

中医古书记载，鳄鱼血具有消炎、清热解毒、消肿瘤等功效，能治疗咳嗽和哮喘等疾病，对肺癌和白血病有疗效．东南亚国家将新鲜鳄鱼血与淘洗后的大米混匀、蒸熟，做成滋补甘甜的热带小吃“鳄鱼血米饭”．现代研究表明，鳄鱼血有两大显著的功能特点．鳄鱼全血、血红蛋白、血清、血浆和白细胞有抗细菌、真菌、病毒和抗癌活性，有可能开发出抗金黄色葡萄球菌等抗药性强的“超级病菌”的抗生素和抗艾滋病毒的药物．另一个显著功能特点是，鳄鱼血红蛋白的携氧量是其他动物的100倍以上，血红蛋白分子中与碳酸氢根离子结合的区域有特殊氨基酸序列，与碳酸氢盐有很高的亲和力．该区域在高二氧化碳条件下可发生独特的变构效应，降低血红蛋白对氧的亲和力，释放出所携带的氧气．这是鳄鱼能在水下屏气1 h以上的原因［3-4］．鳄鱼血红蛋白的这一结构和功能特性可用于设计改造和生产高携氧活性的人工血红蛋白［5］．

1．1 鳄鱼血的抗菌、抗病毒和抗癌活性

(1)抗菌活性．研究表明，鳄鱼血清有较强的抗菌、抗病毒和抗癌活性．Merchant等［6］报道，鳄鱼和人血清都表现出时间和浓度依赖性的抑制大肠杆菌增殖的活性．鳄鱼血清处理5 min后就表现出显著的抗菌活性，20min抗菌活性达到最高．鳄鱼血清的抑菌活性是人血清的10倍．而且，鳄鱼血清可抑制所有测试细菌，而人血清只对35%的测试菌有抑制作用．Kommanee等［7］报道，暹罗鳄血浆对4株临床分离菌(表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、霍乱弧菌)和6株参考菌 (金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、霍乱弧菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌)都有显著的抗菌活性．其中对3株参考菌(伤寒沙门菌、霍乱弧菌、表皮葡萄球菌)和2株临床分离菌(伤寒沙门菌、霍乱弧菌)的抗菌活性最强．许东晖等［8］的研究也表明，鳄鱼血浆对12种菌株中的8种有一定的抑菌作用．鳄鱼血清也有类似的抗变形虫的活性［9］．

(2)抗病毒活性．Merchant等［10］报道，野生美洲鳄鱼血清有抗人类艾滋病毒HIV-I、抗西尼罗河病毒WNV和抗单纯疱疹病毒HSV-1的活性．抑制这3种病毒50%活性所需要的血清浓度(IC50)分别为0．9%、4．3%和3．45%．而用于病毒活性分析的哺乳动物细胞50%活性所需要的血清浓度分别为32．8%(HIV-1)、36．3%(WNV)和 39．1%(HSV-1)．结果表明，鳄鱼血清在较低浓度时对病毒有显著的抑制作用，而对哺乳动物细胞的抑制作用很小．但高浓度的鳄鱼血清也抑制哺乳动物细胞．

(3)抗癌活性．赓迪等［11］报道，人工养殖的暹罗鳄血清和血浆具有抗肿瘤作用．用鳄血清和血浆处理4种体外肿瘤细胞株和体内移植性肿瘤S180荷瘤鼠，较高浓度的鳄鱼血清和血浆对 HepG2、BGC823、HeLa细胞和SKOV3细胞增殖有抑制作用．鳄鱼全血抑制荷瘤鼠肿瘤的生长，抑制率为57．55%，且能改善荷瘤小鼠的生存质量．

1．2 鳄鱼血清补体蛋白提高机体免疫和抗菌功能

鳄鱼血清的抗菌［6］和抗 HIV-1 病毒［10］的活性对热处理敏感，56℃高温处理血清30 min，其抗菌活性丧失;温度低于15℃时抗菌活性也显著降低．表明鳄鱼血清的抗菌活性物质是蛋白成分，可能为活性的血清补体．但鳄鱼血清抗WNV和抗HSV-1的活性则对热处理不敏感，可能不是作为补体起作用的［10］．说明鳄鱼血清中存在2种不同类型的抗菌活性成分．红细胞的补体致敏可导致红细胞破坏，改变红细胞周围的天然补体调节蛋白水平可导致溶血［12］．Merchant等［13］用不同量的鳄鱼血清与未经抗体致敏的绵羊红细胞共培养，可产生浓度依赖的溶血活性．用此方法测定鳄鱼血清的补体活性．结果表明，鳄鱼血清引起的绵羊红细胞溶血活性不受经典的补体级联反应灭活剂氢氧化胺和甲胺的影响，但被EDTA和水杨醛肟所抑制．表明鳄鱼血清的溶血活性是通过替代途径起作用的．电泳分析表明，鳄鱼血清中含有抗原性类似于人类C3的蛋白;Western印迹分析在鳄鱼血清中检测到2种与人类C3α和C3β的分子量几乎相同的蛋白．抗人C3抗体可使鳄鱼血清的溶血活性和抗菌活性显著降低．鳄鱼血清引起的溶血活性在低于15℃和高于30℃时皆降低．该研究表明，鳄鱼血清的抗菌活性部分地由于血清补体促进的体液免疫应答类似物．Aree等［14］表明，新鲜鳄鱼血清、冷冻干燥的血清和冷冻干燥的全血都能增加小鼠巨噬细胞对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的吞噬作用，但冷冻干燥的全血较新鲜血清和冷冻干燥血清的作用小．鳄鱼血清经56℃热处理30min后，这种活性丧失．该研究进一步表明鳄鱼血清中的补体蛋白在调节吞噬过程中起作用．鳄鱼血清通过其蛋白补体的作用增强巨噬细胞的吞噬活性，可作为替代药物用于增强人体的免疫反应．

Merchant等［15］发现，鳄鱼血清的补体活性可被EDTA和其他二价金属离子螯合剂(如磷酸盐和柠檬酸盐)所抑制．5 mM EDTA可完全抑制鳄鱼血清的活性．EDTA对鳄鱼血清活性的抑制作用可被外加5 mM Ca2+或 Mg2+完全恢复，但不能被 Cu2+、Ba2+或Fe2+所恢复．该结果表明，像人血清一样，鳄鱼血清补体的作用需要特殊的二价金属离子Ca2+和/或Mg2+的存在．鳄鱼血清的补体活性最适温度为25～30℃，温度低于25℃或高于35℃都使活性降低［16-17］．二价金属离子对鳄鱼血清补体活性的影响，在鳄血清与未致敏的绵羊红细胞混合培养的溶血试验中也获得了同样的结果［17］．

1．3 鳄鱼血中抗菌肽直接作用于细菌细胞膜

(1)血清/血浆．Preecharram 等［18］从泰国暹罗鳄血清中分离纯化出6个抗多种微生物的抗菌肽(Hp14、Hp15、Hp17、Hp31、Hp36 和 Hp51)．MALDITOF-MS分析表明，Hp14、Hp15和 Hp51的分子量都小于1 kDa．扫描电镜观察表明，这些抗菌肽作用于细菌细胞膜．Preecharram等［19］从暹罗鳄血浆中分离和部分纯化出1个抗菌化合物，命名为crocosin．质谱分析表明，该抗菌活性物含m/z 94和136的重复单元，能穿透到细菌细胞质中，干扰和破坏细胞膜．Kommanee等［7］报道，暹罗鳄血浆中的抗菌物质可渗透到伤寒沙门菌的细胞质中，干扰和破坏细菌膜，但对巨噬细胞样细胞RAW 264．7无毒性．

(2)白细胞．Merchant等［20］报道，野生美洲鳄白细胞酸性提取物中的1～10 kDa组分对8种Candida酵母菌中的6种有强抑制作用，对12种细菌中的10种有抑制作用，对人艾滋病毒HIV-1和单纯疱疹病毒HSV-1有一定的抑制作用．抗真菌动力学分析表明，64%的真菌生长抑制作用发生在3 min内．抗菌活性物质对蛋白酶敏感、对温度不敏感，表明活性物质为阳离子多肽．Pata等［21］从泰国暹罗鳄的白血细胞提取物中分离出4个新的抗菌肽LeucrocinⅠ-Ⅳ．这些肽由7～10个不同氨基酸残基组成，对葡萄球菌、伤寒杆菌和霍乱弧菌有很强的抗菌活性．Leucrocin I的氨基酸序列为 NGVQPKY，分子量806．99 Da;Leucrocin II的序列为 NAGSLLSGWG，分子量956．3 Da．荧光显微镜和电子显微镜观察表明，这些抗菌肽都作用于细菌的细胞膜．溶血试验表明，Leucrocin I，III and IV对人红血细胞的毒性比Leucrocin II小．Yaraksa 等［22］根据 Leucrocin I的序列，分别合成了由D-氨基酸和L-氨基酸组成的Leucrocin I，即D-NY15和L-NY15．分析了它们对球形芽孢杆菌TISTR 678、伤寒沙门氏菌ATCC 5784、大肠杆菌0157:H7和临床分离的巨大芽孢杆菌、霍乱弧菌、伤寒沙门菌的抗菌活性．表明全部用D-氨基酸合成的Leucrocin I比相应的L-氨基酸合成的对映体活性更高．L-NY15和D-NY15在溶菌浓度下对哺乳动物细胞无毒．Theansungnoen等［23］也从暹罗鳄白细胞提取物中分离出2个有强抗氧化活性的多肽，TDVLGLPAK(912．5 Da)和 DPNAALPAGPR(1 148．6 Da)，它们的 IC50 值分别为 153．4 μM 和95．7 μM．

(3)血红蛋白．Srihongthong 等［24］报道，暹罗鳄血红蛋白的α-和β亚基及其降解片段都有抗菌和抗氧化活性，活性由氨基酸残基和结构决定，与血红素无关．研究者分离纯化得到13个来源于α-球蛋白链和β-球蛋白链的活性肽片段．这些活性肽大部分是2条球蛋白链的N-末端和C-末端部分．活性肽通过对细胞膜的作用产生抗菌活性．Jandaruang等［25］表明，鳄鱼血红蛋白对热不稳定，65℃处理导致不可逆变性，但热处理不影响其抗氧化活性;鳄鱼血红蛋白在pH 3．5～4．5时结构稳定，过低或过高都导致抗氧化活性降低．Deepthi等［26］分离纯化和结晶了鳄鱼血红蛋白，并测定了其晶体结构．Anwised等［27］从暹罗鳄鱼中克隆出编码α-(141个氨基酸)和 β-(146个氨基酸)球蛋白的cDNA，并在大肠杆菌中表达出可与血红素和氧结合的活性蛋白．

(4)铁调素．铁调素 (hepcidin)是在许多动物中发现的富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽，在人类抗击病原体感染中起着重要作用．Hao等［28］克隆出了暹罗鳄铁调素(Cshepc)的cDNA．该基因编码99个氨基酸的前铁调素．与人类铁调素相似，鳄鱼铁调素也含8个半胱氨酸组成的4对保守的二硫键．组织表达分析表明，Cshepc在鳄鱼的肝、肌肉和心脏中有高的表达．重组表达的鳄鱼铁调素可显著抑制革兰氏阴性菌(大肠杆菌和单胞菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)的生长．像人铁调素一样，鳄鱼铁调素作为先天免疫反应在抗菌中发挥作用．

1．4 鳄鱼血中的其他功能成分

鳄鱼血液中还有丰富的超氧化物歧化酶(SOD)、磷脂酶A2(PLA2)和二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase IV，DPP4)．鳄血清分泌的磷脂酶A2(PLA2)在5 min内就表现出显著活性，20 min达到最高;低温(5～10℃)和高温30～40℃下酶活性都显著降低;该酶活性可被特殊的PLA2分泌抑制剂所抑制［29］．Merchant等［30-31］表明，美洲鳄血清中高活性的二肽基肽酶4与细胞表面和可溶性CD26相连;酶活性对温度敏感，在5～40℃范围内随温度升高而增加，可被DAPP4特异性抑制剂diprotin A所抑制．鳄鱼血液中的这些酶可能与提高自身免疫反应和释放小分子抗菌肽有关．

2 鳄鱼其他组织器官的功能研究

2．1 鳄鱼肉

鳄鱼肉是低脂肪、高蛋白、富含不饱和脂肪酸、矿物质和维生素的高品质肉类［32-35］．我国自夏商、周朝开始取鳄肉为食，其肉嫩味佳．研究表明，加工和食用鳄鱼肉是安全的［36-37］．鳄鱼肉能提高血液携氧量，使咳嗽、哮喘患者肺氧交换量增加，改善机体缺氧症状等，具有补气血和滋心润肺等功效，对咳嗽、哮喘、风湿和糖尿病有较好的治疗效果．鳄鱼肌肉含多不饱和脂肪酸，可防止心脑血管疾病等．鳄鱼肉的蛋白酶解多肽有抗氧化、促进T淋巴细胞增殖、提高耐缺氧能力、减轻神经细胞损伤和增强免疫力等功能［38-41］．

2．2 鳄鱼油

鳄鱼油含不饱和脂肪酸高达71．5%，其中主要为亚油酸和花生四稀酸．其脂肪酸组成有深海鱼的特点，二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA，俗称脑黄金)含量较高．本草纲目记载，鳄鱼油脂主治皮肤病和恶疮．现代实验证明，鳄鱼油有防冻伤、抗菌消炎、促进血液循环、舒筋和消除疲劳的功能，已用于多种国际知名化妆品及防冻伤和消炎等保健产品．Buthelezi等［42］研究了尼罗鳄油的脂肪酸成分和抗菌与抗炎活性．从中鉴定了16种脂肪酸，其中以油酸、棕榈酸和亚油酸为主要成分．鳄鱼油抗细菌和抗真菌的最适浓度分别为15%和6%(重量/体积)．鳄鱼油对细菌的抗性没有显著的菌种选择性，但对白色念珠菌更敏感．抗炎实验表明，口服给药(60．8±5．5%)时，3 h达到最佳活性;局部给药(57．5±5．9%)时，12 h达到最佳活性．Li等［43］的研究表明，暹罗鳄油能增强皮肤烧伤面的愈合和减少大鼠瘢痕形成．鳄鱼油促进皮肤烧伤愈合可能与TGF-β1/Smad3信号途径有关．

2．3 鳄鱼胆汁

鳄鱼胆含20多种胆汁酸和胆汁醇等．研究表明，鳄鱼胆汁提取物［44］及其活性成分 ESC-3［45］能显著抑制胆管癌细胞QBC939和人肝癌细胞SMMC-7721［46］的生长，处理的细胞停滞在G1期，并诱导癌细胞产生剂量依赖性的细胞凋亡．处理48 h的细胞表现出典型的凋亡形态学改变．胆汁物处理下调Bcl-2蛋白表达和上调Bax表达，导致细胞内Bax对Bcl-2的比率增加;同时，与活性氧增加有关Survivin与c-Myc的表达降低、P53表达增加．研究者认为，胆汁物可能通过线粒体途径、破坏线粒体膜电位和提高活性氧含量来诱导细胞凋亡．

2．4 鳄鱼其他器官

鳄鱼皮是优质高档皮革原料，在国际上有很高的声誉，可制作成皮衣、皮鞋、皮箱、皮带和皮包等名贵用品和装饰品．鳄鱼皮含有大量胶原蛋白，有润肤养颜和防治骨质疏松等作用．鳄鱼皮的酶解物有较强的抗氧化能力［47］．鳄鱼骨有强筋健骨、填精益髓等功能，对风湿骨痛有疗效．鳄骨粉中含大量活性钙和磷等，可防治老年骨质疏松和婴幼儿缺钙等［48-49］．鳄鱼掌和鳄鱼甲富含胶原蛋白，有补肾固精和护肤养颜的功效，可增强皮肤弹性和消除皱纹．鳄鱼肝有补脑、养肝、明目等功效，可治疗老年性白内障和视力减退等多种眼病、再生障碍性贫血和白血病等．鳄鱼肾补肾益气，可改善环境污染等造成的肺功能损害．鳄鱼卵是卵磷脂含量最高的蛋类之一，有消除血管内脂肪、保护肝和心脏、防止老年痴呆及动脉硬化等功效．Chui等［50］的研究表明，鳄鱼卵提取物与野生人参和天然灵芝的混合物对大鼠急性髓性白血病的增殖有强抑制作用，高剂量处理时无急性毒性．鳄鱼鞭有特效的壮阳作用，无任何副作用［51-52］．Shaharabany等［53］测定了多种生活在病源菌环境中的动物组织提取物的抗菌活性．发现鳄鱼(C．niloticus)的肺和肾上腺组织提取物有一定的抗菌活性，但较乌鸦(Corvus corax)的胃、肺、肝和肠等提取物的活性低．如前所述，鳄鱼铁调素在肝、肌肉和心脏中有高的表达［28］．

3 鳄鱼的驯养繁殖

在我国从事鳄鱼的驯养繁殖必须申请“国家重点保护野生动物驯养繁殖许可证”．鳄鱼繁殖能力强，饲养相对比较容易．近年来，随着国际市场对鳄鱼制品需求日益增长，人工鳄鱼养殖迅速发展．我国在广东、海南、福建、安徽、湖北、浙江和上海等地有100多家鳄类养殖单位，养殖数十万尾鳄．鳄鱼养殖的种类除尼罗鳄、湾鳄和暹罗鳄外，扬子鳄、凯门鳄(Caiman crocodilus)、美洲鳄(C．acutus)和密西西比鳄(Alligatormississipiensis)等也有养殖．泰国暹罗鳄为中型鳄，具有繁殖能力强、生长快、抗病力强和皮质优良等优点，在泰国大量养殖，也是我国人工饲养量最多的鳄鱼之一．湾鳄为大型鳄，长达5～6 m，质量约1 t，最长的达7 m、质量1．6 t，是现存最大的爬行动物．湾鳄分布于东南亚沿海到澳大利亚北部，可生活于海水中，适合于海湾或近海养殖．湾鳄生长快、皮质好，适合于我国华南地区饲养．尼罗鳄是从南非引进的大型鳄，生长快．我国特产的扬子鳄是鳄类中分布纬度最北的一种，适合于长江流域、华南和西南地区饲养，但体型小，生长较慢［54］．

鳄鱼以鱼类和动物肉类为食物，也可用动物和鱼类加工的内脏等下脚料饲养．台湾利用眼镜鳄吞食死猪、胎衣及废弃的家禽家畜内脏等，为养猪户处理动物废弃物，消除畜牧业产生的环境污染［54］．鳄鱼作为食用动物养殖，需在无污染的良好环境条件下养殖，食物以鲜活罗非鱼、鳝等肉类为佳，禁用变质或污染肉类食物［55］．鳄鱼不耐寒，最适生长气温28～34℃、水温不低于18℃．气温低于25℃、水温低于15℃时停止进食等活动［56］．鳄鱼5～6月交配，7～8月产卵，经过2～3个月孵化出幼鳄．10岁以上的母鳄每年产卵20～90个(一般40～60个)．母鳄产卵年限可达数十年至上百年．幼鳄的性别由卵孵化时的温度决定，孵化的30～45天为热敏期．28～31℃下孵化出的幼鳄全为雌性，32℃孵化出的幼鳄雄性率较高，可达66%，32～33℃下孵出的幼鳄全部为雄性．温度低于26℃或高于34℃可导致卵死亡．母鳄将孵化巢建在向阳坡或低凹遮蔽处来控制孵化温度和平衡后代性别比．

由于各地气候和生态条件不同，鳄鱼养殖品种差异较大，养殖技术还不很成熟，养殖周期较长，至少需要3～5年，有的需要养殖10年以上．而且，饲养鳄鱼数量一般需要达到10万条的规模，才能满足现代化鳄皮和肉类加工厂的需求．因此，鳄类养殖被认为是高投入、高风险和高回报的产业，需要强大的资金支持．

4 问题与展望

鳄鱼作为地球上最古老的生物之一，具有很高的研究价值．鳄鱼皮的高工业利用价值、鳄鱼肉的高营养与保健价值及鳄鱼血等组织器官的医药开发价值，使鳄鱼成为高经济价值的养殖动物．此外，鳄鱼有强大的自身免疫系统［57］，很少得病和死亡．鳄鱼还有非常强盛的消化和吸收系统，鳄鱼能全部消化和吸收食物中的有机物，其排泄物为石灰样的白色无机物粉末、无有机物残留、无臭味．因此，鳄鱼养殖场与其他动物养殖场不同，无气味和排泄物污染．众多的特点使鳄鱼成为热门养殖动物．

鳄鱼养殖方面的研究较少，特别是鳄鱼养殖饲料和营养等方面的研究．由于鳄鱼的生长周期较长，目前可用于加工的鳄鱼资源不多．鳄鱼的规模化加工和资源综合开发利用等还停留在初步研究阶段．尽管已有许多关于鳄鱼或其提取物的抗菌、抗病毒和抗肿瘤等研究，但迄今国际上还没有成功开发出有效的以鳄鱼为原料的治疗药物．鳄鱼的抗菌活性成分及其活性大小等还需要进一步研究，这些活性成分在哺乳动物或人体内的作用效果等还未见报道．将鳄鱼血等开发成有明确治疗效果的药物还需要大量的研究．

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