人肝癌细胞系7402、7721及癌旁肝细胞7701在重组腺病毒-胸苷激酶/更昔洛韦系统作用前后差异蛋白检测及CK18表达

朱艳培，李 宁，陶 莹，王 珏，于 玮，戴 洁*（.首都医科大学临床病理中心，北京 00069；.首都医科大学附属北京佑安医院肝胆外科，北京 00069；.首都医科大学附属北京安贞医院病理科，北京0009）

·论著·

人肝癌细胞系7402、7721及癌旁肝细胞7701在重组腺病毒-胸苷激酶/更昔洛韦系统作用前后差异蛋白检测及CK18表达

朱艳培1，李 宁2，陶 莹1，王 珏1，于 玮3，戴 洁1*
（1.首都医科大学临床病理中心，北京 100069；2.首都医科大学附属北京佑安医院肝胆外科，北京 100069；3.首都医科大学附属北京安贞医院病理科，北京100029）

目的检测重组腺病毒-胸苷激酶/更昔洛韦（adenovirus-thymidine kinase/gancyclovir,ADV-TK/GCV）系统作用前后人肝癌细胞株7402、7721及癌旁肝细胞7701差异蛋白表达，进一步阐明ADV-TK/GCV自杀基因系统作用机制。方法利用肽质量指纹图谱和双向电泳分析法检测ADV-TK/GCV系统对人肝癌细胞7402、7721及癌旁肝细胞7701作用前后的差异蛋白；常规病理学技术苏木精伊红染色、电子显微镜技术观察作用前后细胞病理形态学改变；免疫细胞化学方法检测细胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）的表达部位、分布范围及量的变化。结果7721及7701对ADV-TK/GCV系统作用不敏感，人肝癌细胞7402经自杀基因药物作用后，多种蛋白表达呈现出差异性，差异点主要表现为与物质能量代谢相关的酶类及与细胞骨架相关的蛋白，7402细胞的CK18表达上调明显。加药组7402细胞死亡明显，残留细胞体积变大，胞浆疏松，空泡变性。电镜观察显示加药组细胞器水肿，变化明显，微丝增多，且多分布于核周围，凋亡现象明显。7402免疫细胞化学染色显示加药组CK18的表达增强且向核周聚集。结论ADV-TK/GCV自杀基因系统作用后，敏感株7402蛋白表达具有差异性，其中CK18表达显著上调且出现分布改变，并引起细胞形态学的变化。

肝肿瘤；差异蛋白；角蛋白质类

原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，其因临床发现晚，中晚期治疗效果差而成为临床上肿瘤治疗的难点[1]。近年来生物治疗已成为原发性肝癌的治疗方法之一，基因治疗已经显示出了潜在的疗效及良好的发展前景[2]。自杀基因又称为前药转换酶基因，可以编码特殊的酶，催化原先无毒、低毒的前药形成有较高毒性的代谢产物，从而达到杀死肿瘤细胞的目的，并具有先转染后治疗、易控制的优点[3]，为了进一步阐明重组腺病毒-胸苷激酶/更昔洛韦（adenovirus-thymidinekinase/gancyclovir,ADV-TK/GCV）自杀基因治疗系统的作用机制，我们通过从体外培养的肿瘤细胞株中提取蛋白[4]进行ADV-TK/GCV系统作用前后的差异性检测，试图寻找ADV-TK/GCV自杀基因治疗系统的作用前后蛋白质组的差异性，为肝癌等肿瘤的自杀基因治疗提供治疗及效果评价的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料：选用高转移、对基因治疗敏感的Bel-7402作为实验组，高转移、对基因治疗不敏感的SMMC-7721和癌旁肝细胞株QSG-7701为对照组，3株细胞购于北京协和医科大学细胞库。

细胞培养基DMEM购于Gibco公司；ADV-TK购于深圳市天达康基因工程有限公司；辅助用药GCV购于湖北科益药业；差异蛋白检测试剂购于Sigma公司；一抗鼠抗人CK18、PV9002、山羊血清工作液及HE染色试剂购于北京中杉金桥有限公司；电镜染色试剂购于中镜科仪技术有限公司。

细胞培养箱购于SANYO公司；石蜡切片机和超薄切片机购于德国Leica公司；透射电镜购于日本JEOL公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理：取7402、7721及7701三株细胞，设立实验组7402（﹢），以ADV-TK和GCV分别处理，对照组7402（-）、7721（-）及7701（-）以等量PBS和GCV处理。以5×105细胞/瓶接种于25cm2细胞培养瓶中，加入含10% 胎牛血清的DMEM培养基5mL，对照组与实验组各10瓶进行培养。12h后，换液，各组每瓶加入4.9mLDMEM，然后实验组每瓶加入100μL基因制剂ADV-TK,浓度为5×1010/mL（经预实验50%致死率确定），对照组加入等量PBS。温箱孵育24h，所有细胞每瓶加入GCV25μL,浓度为2.5×10-4g/mL，使终浓度为1.25×10-6g/mL，48h后用细胞刮刮取细胞，冻存。

1.2.2 蛋白提取:取各组冻干细胞，每管中加入1×全细胞裂解液10μL,超声粉碎（冰上进行），4℃离心机，12 000r/min离心5min，取上清液，利用BCA蛋白定量试剂盒的微量测试法，制作标准曲线，测定蛋白浓度。

1.2.3 双向电泳实验:将提出的各组蛋白经固相pH梯度等电聚焦，平衡、垂直平板电泳，考马斯亮蓝染色及采集与分析蛋白图象。1.0mg细胞总蛋白与重泡涨液（8mol/L尿素,2% 3-[3-（胆酰氨丙基）二甲氨基]丙碘酸丙盐，0.5%固化电解质梯度（immobilineTMDrystrip，IPG）缓冲液1.75L,20mmol/L二硫苏糖醇7L,痕量溴酚蓝）混合并加入IPG胶槽中，覆盖油覆盖IPG胶条，置于固相pH梯度等电聚焦仪中聚焦；然后用含十二烷基磺酸钠的平衡液平衡；将平衡好的IPG胶条转移至13%聚丙烯酰胺均胶质中进行垂直平板电泳，20mA/胶电泳40min后换用30mA/胶，直至溴酚蓝前沿抵玻璃板下缘；最后进行考马斯亮蓝染色及采集与分析蛋白图象。

1.2.4 肽质量指纹图谱鉴定蛋白质的差异性:将电泳后凝胶中蛋白点切出后，放入含50%乙腈、25mmol/LNH4HCO3的溶液，涡旋混合器振荡约30min脱色，真空离心干燥，在干燥好的胶块上加入胰蛋白酶酶液（0.01g/L，在25mmol/LNH4HCO3溶液内）进行切割，4℃放置15min使酶液完全被吸收，另补加25mmol/LNH4HCO3溶液保湿，37℃温浴18～20h，收集酶切后的上清进行肽段提取后，使用布鲁克道尔顿公司的AB4700 的MALDI-TOF/TOF-MS进行PMF图象收集及在线检索。仪器设置20kV，正离子，基质用α-氰基-4羟基肉桂酸，内标按照胰蛋白酶自切峰2163.05为校正标准，外标为7种标准肽段的混合物。

1.2.5 7402细胞HE染色:细胞爬片，3×104/孔接种于24孔板，每孔加入500μL完全DMEM培养基，12h后，换液，实验组每孔加入400mLDMEM，100μL基因制剂ADV-TK,浓度为1×109/mL，对照组加入等量PBS。温箱孵育24h，每瓶加入GCV125μL,浓度为1.25×10-6g/mL，48h后,4%多聚甲醛固定30min。苏木精-伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.2.6CK18免疫细胞化学染色:细胞爬片，加药，固定2h后，3%H2O2孵育15min,正常山羊血清封闭,滴加一抗浓度1∶200,4 ℃孵育过夜;加二抗工作液,DAB镜下显色;苏木精复染,酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。

1.2.7 透射电镜观察:细胞用PBS清洗，离心成 1 小块，3%戊二醛固定4h，脱水，包埋，聚合，超薄切片，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察。

2 结 果

2.1 差异蛋白检测结果:肝癌细胞7721及癌旁肝细胞7701经自杀基因药物作用后，细胞生长及形态学改变不明显，蛋白表达无明显差异。实验组肝癌细胞7402处理后，多种蛋白表达呈现出差异性，在11个差异最为明显的蛋白质组中，有6组明显下调的差异点主要为与物质能量代谢相关的酶类，有5组明显上调的差异点，其中有3组差异点与角蛋白相关。经比较分析CK18表达上调最为明显（图1，2）。

2.2 7402细胞HE染色细胞形态改变:实验组细胞死亡明显，残留细胞体积变大，变圆，浓染，可见空泡变性，胞浆疏松（图3A）；对照组细胞大多呈梭形，核仁明显（图3B）。

2.3 免疫细胞化学染色细胞形态改变:实验组CK18的表达增强且分布不均，主要集中在核膜周围胞质中，部分呈环状分布（图3C）；对照组CK18的表达在胞浆和胞膜均匀分布（图3D）。

2.4 透射电镜观察细胞超微结构改变:细胞超微结构明显变化，未加药组胞浆内可见粗面内质网、滑面内质网、丰富的核糖体及大量溶酶体等细胞器结构，部分细胞内含脂滴，细胞表面绒毛明显，偶见变性的线粒体、凋亡癌细胞。加药组细胞变圆，细胞表面绒毛减少，大多数细胞器变性，可见空泡变性（图4A），滑面内质网扩张，线粒体减少，溶酶体增多，胞浆内微丝结构增多，并多分布于细胞核周围（图4B）。部分细胞胞浆浓缩，电子密度增高，细胞器结构不清楚，核固缩，脂滴相对减少，并可见凋亡小体（图4C）。

3 讨 论

蛋白质组学是后基因组研究中最主要的部分，主要从两个方面加以研究，一方面是“完全”蛋白质组学，目的是检测一种细胞或一种组织内基因组表达的所有蛋白质，另一方面是“差异”蛋白质组学，目的是寻找和筛选任何有意义的因素引起的两个样本之间的差异蛋白质谱，同时对所获得的某些蛋白进行功能分析及定性[5]。常用的蛋白质组学相关技术包括双向电泳技术、生物质谱技术、生物信息学技术等[6]。有学者利用双向凝胶电泳等蛋白质组学技术进行肝癌的蛋白分析，发现61个蛋白表达上调点，158个下调点，其中71个基因产物已得到证实，并首次发现在肝癌组织样本中，热激蛋白70、90和核糖核蛋白C1、C2的过表达，这些都为寻找肝癌的潜在蛋白标志物提供了依据[7]。目前，在肝癌生物治疗的基础和临床研究中，基因治疗已经显示出了良好的发展前景，而自杀基因治疗为主要采用的手段之一[8]。ADV-TK/GCV自杀基因系统又称重组腺病毒介导胸昔激酶/更昔洛韦系统，ADV-TK编码区共1 128个核苷酸，编码的胸苷激酶为376氨基酸构成的蛋白产物，能催化GCV生成三磷酸更昔洛韦，在DNA复制时与脱氧三磷酸鸟苷竞争性的插入DNA，抑制肿瘤细胞DNA链的延伸，并且抑制DNA聚合酶活性，从而杀死肿瘤细胞[9]。但该系统影响肿瘤细胞生长代谢、运动等的相关机制和其所引起的基因及其蛋白质的表达变化报道并不多。

本研究利用肽质量指纹图谱和双向电泳分析法进行ADV-TK/GCV系统对人肝癌细胞7402、7721及癌旁肝细胞7701作用前后的差异蛋白检测，共分析出40个有明显差异的点，其中包括多种最有可能蛋白的上调与下调，对基因治疗的敏感株7402而言，有11个点上调明显，14个点下调明显。差异点主要集中在与物质能量代谢的酶类相关的蛋白质组和与细胞骨架相关的蛋白质组。如下调差异蛋白点所覆盖的蛋白质组可能包括丙酮酸激酶、磷酸甘油酸变位酶及谷胱甘肽S-转移酶等与肿瘤物质能量代谢相关的酶类。除了下调的与细胞物质能量代谢相关的酶类外，上调的细胞骨架成分中，最有可能相对分子质量的蛋白以角蛋白为主要代表，本研究重点观察了CK18的表达特点。

本研究结果显示,CK18在对照组癌旁肝细胞株7701、对基因治疗不敏感的肝癌细胞株7721及处理前的敏感株7402中均为少量表达，而ADV-TK/GCV处理后，只有敏感株7402检测出CK18表达明显增高。本研究结果提示敏感株7402的CK18表达增高与ADV-TK/GCV处理有关，关于CK18的功能，一般认为CK18属于相对分子质量较小的Ⅰ型细胞角蛋白，作为细胞骨架蛋白中间微丝的一种，主要由腺上皮表达，目前被广泛应用于肿瘤的诊断。正常肝脏组织即有CK18的表达，CK18被认为是成熟肝细胞的标志[10]。有学者[11]证实，正常肝组织与肝硬化组织中CK18表达率差异无统计学意义，而肝细胞癌组织CK18表达增高与肝硬化组织中CK18表达率差异有统计学意义。提示CK18参与了从肝硬化到肝细胞癌的癌变过程，认为它也是肝细胞癌的一个潜在的评价指标。

本研究结果表明,经ADV-TK/GCV处理后肝癌细胞形态明显改变，细胞增大变圆，胞浆空泡变性，免疫细胞化学染色显示CK18阳性表达物在未处理组为胞浆弥散分布，处理后阳性产物多聚集在核周。同时，电镜下处理组细胞可见微丝在核周围分布明显增多，作为细胞骨架的微丝结构与细胞生长、运动等关系密切，因此ADV-TK/GCV自杀基因系统处理后CK18的表达及微丝分布的变化可能与肝癌细胞的生长代谢、运动及迁移有关。

同时，在细胞凋亡研究中发现，CK18被Casepase裂解于2个靶点（Asp238和Asp396），由此分解的片段在血液中的浓度稳定，且对细胞凋亡有高度的特异性[12]。凋亡通过内外两条通路发生，最终通过各种酶的激活，从而降解细胞成分，其中就包括中间微丝网状结构的水解断裂及CK18的释放入血，在肝细胞凋亡的过程中，CK18由于蛋白水解酶Caspase的作用释放入血，因此被认为是肝细胞凋亡的指标[13]，目前临床已利用CK18的血清学检测观察治疗效果。本研究发现,ADV-TK/GCV处理后肝癌细胞7402的CK18表达上调及分布改变的同时，电镜下可见凋亡小体增多。

本研究从蛋白质水平证实了ADV-TK/GCV自杀基因系统作用前后肝癌细胞7402在物质能量代谢类蛋白及细胞骨架类蛋白表达上出现明显差异，并从病理形态学水平加以验证，但这种差异是通过何种途径实现的还需继续深入研究。（本文图见封二）

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（本文编辑：赵丽洁）

DETECTIONOFDIFFERENCEPROTEINANDOBSERVATIONOFPATHOMORPHISMONHUMANHEPATOMACARCINOMACELLLINE7402,7721ANDADJACENTLIVERCELL7701BEFOREANDAFTERADV-TK/GCVTREATMENT

ZHUYanpei1,LINing2,TAOYing1,WANGJue1,YUWei3,DAIJie1*
（1.CenterforClinicalPathology,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,BeijingYou’anHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China；3.DepartmentofPathology,BeijingAnzhenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100029,China）

ObjectiveTodetectetheexpressionofthedifferenceproteinsofthehumanhepatomacarcinomacellline7402，7721andadjacentlivercell7701beforeandafterthetreatmentoftheadenovirus-thymidinekinase/gancyclovir（ADV-TK/GCV）system,furtherelucidatingthemechanismofthesuicidegenesystemADV-TK/GCVonhepatomacells.MethodsPeptidemassfingerprinting（PMF）andtwo-dimensionalelectrophoresisanalysiswereusedtotesttheexpressionofthedifferenceproteinsofthehumanhepatomacelllines7402,7721andtheadjacentlivercellline7701beforeandafterthetreatmentoftheADV-TK/GCVsystem;moreover,weobservedthecellpathologicalmorphologychangesafterthetreatmentwithHemateinEosin（HE）,oneoftheroutinemethodsofpathology.Wealsousedtheelectron-microscopytodetecttheexpressionport,distributionandquantityofcytokeratin18 （CK18）ofdosinggroupandcontrolgroupwithimmunohistochemistry.Results7721and7701weresensitivetoADV-TK/GCVsystem.Theexpressionofmanyproteinsofthehumanhepatomacelllines7402,exhibiteddifferencesafterthedisposalmethodofsuicidegenedrugs,theexpressionofCK18wasupregulatedobviouslybycomparativeanalysis.CellularmorphologychangedsignificantlybyHE.Cellsinthecontrolgroupweremostlyspindle-shapedandnucleoliwereobvious,whilemostcellsindosinggroupdied.Thevolumeofresidualcellwassmall,round,andhyperchromatic.Electronmicroscopyobservationsshowedthatthecontrolabundantorganelles,accidentallysawcellapoptosis.Dosinggroupofcellorganellewereoedematousobviously,microfilamentincreasedandthroughoutaroundthenucleus,apoptosisphenomenonwasobvious.TheimmunocytochemistryshowedthattheexpressionofCK18ofthecontrolgroupwasequallydistributedinthecytoplasmandcellmembrane,buttheexpressionofCK18ofthetreatmentgroupincreasedandwasunevendistribution,mainlyconcentratedinthemembranesurroundingthecytoplasm,someofwhichwerecirculardistribution.ConclusionAfterthesuicidegenesystemADV-TK/GCVplayedarole,proteinexpressionofthesensitiveline7402showeddifferences,whichsuggestedtheexpressionofCK18upregulatedmemorably,thedistributionpresenteddifferencesandcausedchangesinthemorphology.

liverneoplasms;differentiallyexpressedproteins;keratins

2013-10-30；

2014-01-16

国家科技部传染病防治重大专项（2008ZX10002-026）

朱艳培（1987-），女，云南楚雄人，首都医科大学医学硕士研究生，从事肝癌自杀基因治疗研究。

R735.7

A

1007-3205（2014）05-0546-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.05.017

*通讯作者