水通道蛋白-4抗体阳性患者血清抗Hu、Yo抗体的检测

龙友明 单福兰 解龙昌 陈梦宇 郑杨波 高聪 杨宁

视神经脊髓炎(Neuromyelitis optica, NMO)免疫球蛋白G(NMO-IgG)的发现源于肿瘤患者血清中副肿瘤综合征抗体的筛查[1]。NMO-IgG实质是水通道蛋白-4(aquaporin-4, AQP4)抗体[2]，即AQP4抗体，是区分NMO与多发性硬化的特异性标记物[3-4]。研究表明，AQP4抗体不仅出现于NMO、视神经炎、脊髓炎患者，亦可见于其他疾病，包括无视神经炎、脊髓炎的肿瘤患者[1]。副肿瘤综合征是原发性恶性肿瘤对神经系统和/或骨骼肌远隔效应所引起的一组临床症状群，抗Hu抗体和抗Yo抗体是其最常见的标志物。AQP4抗体发现者Pittock等认为在某些NMO患者中，AQP4抗体本身也是副肿瘤免疫反应的标志物[1]。但目前尚无进一步的研究显示抗Hu抗体和抗Yo等抗体在AQP4抗体阳性的患者中出现。本研究旨在观察抗Hu抗体和抗Yo抗体在80例AQP4抗体阳性的患者出现情况并分析其临床意义。

1 对象和方法

1.1观察对象收集2012-10-2013-07在作者医院神经内科检测AQP4抗体阳性的患者80例，其中男5例、女75例，中位起病年龄38岁(16～73岁)，59例(73.7%)符合2006年NMO的诊断标准[5]， 2例(2.5%)诊断为复发性视神经炎[3]，13例(16.3%)诊断为长节段脊髓炎(脊髓连续病灶长度在MRI上超过3个脊椎节段)[3,5]，其余6例(7.5%)患者表现为孤立的脑干综合征[6]。其中仅1例(1.25%)复发性长节段脊髓炎患者有明确晚期结肠癌。

1.2方法猴小脑的冰冻切片和抗Hu、Yo抗体的标准液，AQP4抗体的检测试剂盒(HEK-293细胞)，均购自德国EUROIMMUN公司。

1.2.1AQP4抗体检测：所有的患者都接受AQP4抗体的检测。参考文献[7]的方法：(1)10 μL待测血清加入PBS液90 μL稀释(1∶10)；(2)将25 μL稀释后的待测血清样本加至加样板的反应区，盖上包被有转染和非转染AQP4基因细胞的玻片，室温育30 min；(3)PBS冲洗1次，并浸泡5 min；(4)取20 μL FITC标记的抗人IgG，加入加样板，重复(2)、(3)步骤后封片，于20倍荧光显微镜下观察上述细胞是否存在绿色荧光。结果判断：阳性细胞的胞浆和胞膜出现明显的荧光模式(细胞核不染色)，而阴性细胞不出现任何荧光视为阳性，否则视为阴性结果。

1.2.2Hu、Yo抗体检测：猴小脑冰冻切片，PBS液冲洗5 min×1；加入1∶60稀释的患者血清，室温下结合30 min，PBS冲洗3 min×2；加用荧光素结合的羊抗人IgG的抗体，结合30 min，PBS冲洗3 min×2，甘油-PBS液封片，于20倍荧光显微镜下观察小脑切片的颗粒层和分子层神经元。以抗Hu抗体及抗Yo抗体的标准液替代血清作阳性对照，以PBS液替代血清作阴性对照。小脑灰质神经元细胞核呈现颗粒状荧光为抗Hu抗体阳性；小脑普肯耶细胞形成粗颗粒状染色为抗Yo抗体阳性。

2 结果

80例患者抗Hu抗体均阴性，仅1例NMO患者出现典型的血清Yo抗体，抗体结合于猴小脑的颗粒层普肯耶(Purkinje)细胞，呈特异性荧光模式，抗体滴度为1∶3840。

该抗Yo抗体阳性患者为女性，起病年龄为17岁，病程1年余，无恶性肿瘤病史，2011-10无诱因突发左侧视力下降，只有光感，当时诊断为视神经炎，外院应用甲泼尼龙治疗后视力恢复至眼前指数。2012-02突发双下肢无力和二便障碍，MRI检查提示颈1～颈3和颈6～胸2脊椎节段的长病灶(图1)，头颅MRI未见异常。HEK-293细胞检测血清中AQP4抗体阳性(抗体滴度1∶1000，图2A)，血清Yo抗体阳性(1∶3840，图2B)，患者还存在沉积于肾小球的其他不明抗体(图2C)。患者经甲泼尼龙冲击后，遗留左侧肢体无力，肌力约Ⅴ-级。目前EDSS评分为4分。

图1一例NMO患者的MRI表现：T1加权的脊髓增强可见长节段的颈髓与胸髓病灶(箭头所示)

A：HEK-293细胞结合间接免疫荧光法提显示AQP4抗体阳性(箭头所示；×20)；B：猴小脑冰冻切片结合间接免疫荧光检测提示血清中抗体结合于小脑的Purkinje细胞(箭头所示，×20)，为特征性的Yo抗体； C：患者血清中有不明抗体结合于肾小球(箭头所示；间接免疫荧光×40)

图2一例NMO患者的自身抗体检测结果

3 讨论

AQP4抗体是Lennon等发现的一种NMO疾病特异性的抗体，对NMO与MS的鉴别具有重要的意义[2]。进一步研究显示AQP4抗体具有致病性[8]：AQP4抗体与星形细胞终足、朝向微血管腔内面的AQP4结合，通过抗体依赖性细胞毒作用和补体依赖性粒细胞募集杀伤星形细胞，从而启动后续的炎性反应，导致髓鞘脱失及组织坏死[9]。AQP4抗体最早发现于近20万份肿瘤患者的副肿瘤综合征抗体(抗Hu、Yo抗体等)的筛查过程中，提示副肿瘤综合征抗体与AQP4抗体具有一定关联性[1]。在5万份检测AQP4抗体的患者血清中，阳性患者3587例(7%)，并非全部合并脊髓炎和/或视神经炎，提示AQP4抗体本身不但是NMO的诊断标记物和致病因子，而且可能是肿瘤免疫反应的产物[1]。因此，AQP4抗体可能也是反映副肿瘤综合征的一种抗体，它的出现可能有助于防止肿瘤进一步的扩散[1]。本研究中，80例AQP4抗体阳性的患者中只有1例患者有晚期结肠癌的病史，尚不能确定AQP4抗体与结肠癌的发生具有必然的因果关系。恶性肿瘤患者出现视神经脊髓症状[10]或神经系统的其他表现，如肌无力综合征、脑干脑炎等，临床医生通常考虑副肿瘤综合征可能。但是，根据目前对NMO的认识，AQP4抗体阳性的患者常需要免疫抑制治疗，因此，AQP4抗体阳性的恶性肿瘤患者诊断归类为视神经脊髓炎谱系疾病为宜[6,11]，当AQP4抗体阴性时医生应考虑副肿瘤综合征可能[10]，并检测其他抗体来证实。可见，检测AQP4抗体有助于区分其他副肿瘤综合征抗体引起的NMO样病变。

副肿瘤综合征是原发性恶性肿瘤对神经系统和/或骨骼肌远隔效应所引起的一组临床症状群，其发病与肿瘤免疫产生的自身抗体有关[12]。目前已证实多种抗体可以出现在副肿瘤综合征中，包括抗Hu、Yo、Ma2、CRMP-5、amphiphysin和Ri抗体[13]，以抗-Hu和 Yo抗体最常见，前者多见于小细胞肺癌，后者多见于妇科肿瘤或乳腺癌患者[14]。尽管AQP4抗体的发现源自于副肿瘤综合征抗体的检测，但是还没有相关的研究探讨血清AQP4抗体阳性的患者是否出现副肿瘤综合征抗体。本研究中，通过目前最灵敏和特异的细胞转染方法[7]筛查了80例AQP4抗体阳性的患者，然后以标准的猴小脑冰冻切片的免疫荧光方法筛查抗Hu、抗Yo抗体[14]。参考标准的阳性对照，本组中无抗Hu抗体的出现，仅有1例患者出现抗Yo抗体，且该患者无肿瘤病史。本组80例中79例均无肿瘤病史，提示了抗Hu、抗Yo抗体在无肿瘤史的AQP4抗体阳性的患者中比较少见。由于缺乏肿瘤患者的该抗体检测的大样本研究，尚不能明确肿瘤患者中该抗体的阳性率情况。本次检测中，1例NMO患者抗Yo抗体阳性的临床意义也不能明确。抗-Yo抗体是特异性抗普肯耶细胞抗体，出现于合并副肿瘤小脑变性的乳腺癌、卵巢癌或子宫癌病患者。经免疫组化显示其靶抗原为普肯耶细胞的一种颗粒性胞浆标记物，经Western-blot法已证实相对分子质量34 000及62 000两种已被克隆的抗原[12]。在超过半数的副肿瘤小脑变性病例中，神经系统表现常出现于发现癌肿之前，特征性表现为进展性共济失调、构音障碍和眼球震颤，MRI可见广泛小脑萎缩。本患者并无上述临床特征和恶性肿瘤的证据，因此可排除副肿瘤小脑变性。现已证实NMO患者常出现器官特异或非特异性自身抗体[15]，本研究中该患者出现靶抗原不明的肾小球自身抗体亦符合该病的特点。因此，长期随访患者的临床症状和追踪其是否出现妇科或乳腺恶性肿瘤有助于了解Yo抗体的真正的临床意义。

综上所述，本研究显示，80例AQP4抗体阳性患者中，仅1例出现副肿瘤综合征相关的抗Yo抗体，未发现抗Hu抗体，进一步大样本检测和长期随访副肿瘤综合征抗体阳性的NMO及其谱系疾病有助于了解副肿瘤综合征与AQP4抗体的关系。

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