黄喉拟水龟摩氏摩根菌的分离鉴定及药敏试验

兰 云 胡秀彩 吕爱军 沈晓静 朱爱华 冯照军

(江苏师范大学生命科学学院, 徐州221116)

黄喉拟水龟摩氏摩根菌的分离鉴定及药敏试验

兰 云 胡秀彩 吕爱军 沈晓静 朱爱华 冯照军

(江苏师范大学生命科学学院, 徐州221116)

黄喉拟水龟(Mauremys mutica), 俗称石龟、石金钱龟、黄板龟等, 为龟科拟水龟属, 主要分布于中国江苏、安徽、福建以及越南、日本等。黄喉拟水龟具有食用、药用和观赏价值, 近年来野生资源日趋减少, 人工养殖发展迅速。细菌性病原感染是黄喉拟水龟养殖过程中常见疾病, 目前已报道黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)[1]、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)[2]、摩氏摩根菌(Morganella morganii)[3]、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophmomas maltophilia)和脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)[4]等可引起黄喉拟水龟感染发病。

2013年3—4月, 江苏省徐州市某养殖场暴发黄喉拟水龟细菌性慢性传染病, 病龟临床表现为头肢部溃烂、蜕皮, 爪脱落, 眼睛感染严重以致失明, 行动迟缓、食欲废绝, 有浓重腥臭味, 引起零星死亡。为确定该病病原菌,通过细菌分离鉴定、生化特性及16S rDNA序列分析以及构建系统发育树等方法进行系统鉴定。本文进行摩氏摩根菌的分离鉴定、药敏试验及动物感染试验等研究, 以期为黄喉拟水龟细菌性疾病的诊断与防治提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验动物及症状观察 江苏省徐州市某养殖场饲养的黄喉拟水龟发生细菌性感染疾病, 导致病龟零星死亡, 以发病黄喉拟水龟为试验动物, 并观察记录病龟症状。健康稚龟购自徐州市某花鸟市场, 体重约为8.5 g, 体长约4.5 cm。

试验试剂 LB培养基、细菌生化鉴定管和药敏纸片均购自杭州微生物试剂有限公司; PCR反应试剂2×Taq PCR MasterMix购自南京诺唯赞生物科技有限公司, 细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司; 受体菌 DH5α由实验室保存; DNA Marker、pMD18-T克隆载体购自TaKaRa公司; 引物由上海生工生物技术有限公司合成。

1.2 方法

病原菌分离与纯化 参考李楠等方法进行[5], 病龟体表病灶用无菌生理盐水冲洗, 取病灶组织划线接种于LB培养基, 29℃恒温培养24h; 无菌操作从肝脏、心脏取样, 划线接种于LB培养基, 29℃恒温培养24h。挑取典型单菌落分离纯化, 获得纯种后进行革兰氏染色镜检,并接种于试管斜面保存、备用。

细菌生理生化及药敏试验 参考谭爱萍等方法进行[6], 无菌操作挑取适量细菌接种于细菌生化鉴定管, 29℃恒温培养48h, 观察记录结果。采用K-B法进行药敏试验, 选用24种抗生素对3株细菌进行药敏试验, 29℃培养24h, 测量各种药物的抑菌圈直径, 多次测量取平均值,以判定药物对细菌的抑制作用。

16S rDNA基因克隆测序及系统发育树分析 采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌总DNA, 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测, －20℃保存备用。以总DNA为模板,采用细菌通用引物进行 16S rDNA基因扩增, 正向引物F27: AGTTTGATCATGGCTCAG, 反向引物R1492: GTTA CCTTGTTACGACTT。PCR体系: 2×Taq PCR Master Mix 12.5 µL, 上、下游引物各1 µL, DNA模板1 µL, ddH2O 9.5 µL。PCR反应条件: 94℃预变性4min、94℃变性40s、55℃复性 40s、72℃延伸 1min, 35个循环后 72℃延伸10min。PCR产物与pMDl8-T载体连接, 转化大肠埃希菌DH5α, 筛选阳性克隆, 送上海生工生物工程有限公司测序。分离菌16S rDNA序列通过BLAST和Clustalx l.83软件进行16S rDNA序列比对分析, 采用MEGA.4软件邻接法(Neighbor-joining method)构建系统发育树。

动物感染试验 将3株分离菌分别接种于LB液体培养基29℃培养12h, 取0.5 mL菌液倍比稀释, 倾注平板法测定菌液浓度, 用生理盐水稀释至 1.0×109cfu/mL和1.0×108cfu/mL。稚龟感染试验采用腹腔注射法, 每只稚龟注射菌液 0.1 mL, 对照组注射 0.1 mL无菌生理盐水;饲养温度约为25 , ℃ 连续观察15d、记录实验结果。同时对发病死亡的稚龟进行细菌再分离鉴定。

2 结果

2.1 病龟症状及病原菌分离

2013年3—4月, 徐州某养殖场饲养的黄喉拟水龟发病, 临床症状主要表现为慢性感染(图 1): 头部、四肢、尾部及甲壳边缘部皮肤溃烂, 皮肤组织变白、蜕皮, 有严重的腥臭味; 进一步感染颈部溃烂穿孔, 四肢肌肉、骨骼外露, 爪脱落, 导致零星死亡; 病理解剖可见病龟心脏、肝脏肿大, 肝脏呈暗黑色。

图1 黄喉拟水龟体表症状(箭头为病灶处)Fig. 1 The clinical signs of Mauremys mutica (arrows indicate local lesions)

从黄喉拟水龟病灶处分离得到 1株细菌, 编号为TMM13032; 从心脏、肝脏中各得到1株细菌, 分别编号为TMM13033、TMM13034。3株分离菌在LB培养基上生长良好, 29℃培养24h后菌落均呈乳白色、半透明、中间凸起、表面光滑、湿润、边缘整齐; 3株细菌均为革兰氏染色阴性, 直杆菌(图2)。

图2 TMM13033菌株的菌落及菌体形态Fig. 2 The individual cell and colonies morphologic characteristics of the TMM13033 strain

2.2 生理生化特性

选用35项细菌生化编码鉴定管对分离菌进行生化特性检测, 结果表明TMM13032、TMM13033、TMM13034菌株的生理生化特性基本一致, 能利用葡萄糖产酸产气,有运动性, 发酵型, MR试验、枸橼酸盐、脲酶、鸟氨酸、ONPG、硝酸盐还原和DNA酶试验均为阳性(表1)。以上3株分离菌的培养特性、生理生化特性, 基本符合《伯杰细菌鉴定手册》描述的摩根菌属(Morganella)特征[7]。

图3 三株分离菌的基因组DNA及16S rDNA的PCR扩增结果Fig. 3 The results of genomic DNA and 16S rDNA PCR amplification of the three strains

2.3 菌株16S rDNA基因扩增、测序及系统发育树分析

以3株分离菌基因组DNA为模板, 采用PCR方法扩增其16S rDNA序列, 电泳检测在1500 bp处出现目的条带(图3), 测序获得 TMM13032、TMM13033、TMM13034菌株16S rDNA片段大小分别为1506、1507、1507 bp, 序列递交至 GenBank数据库的登录号分别为KF611894、KF611895、KF611896。将16S rDNA序列通过 Blast软件进行序列同源性检索, TMM13032、TMM13033、TMM13034菌株与摩氏摩根菌(Morganellamorganii)模式株ATCC25830(登录号: AJ301681)同源性分别为98.93%、99.67%、99.07%; 选择14个标准菌株16S rDNA序列构建系统发育树, TMM13032、TMM13033、TMM13034与摩氏摩根菌(M. morganii)自然聚为一支(图4), 结合3株分离菌的理化特征, 鉴定均为摩氏摩根菌。

2.4 动物感染及药敏试验结果

动物感染试验分别以菌液浓度为108、109cfu/mL感染稚龟, 结果表明3株摩氏摩根菌感染2d后出现精神萎。顿、行动迟缓、食欲不振, 个别眼睛有分泌物等症状, 感染 3d后出现死亡现象, 死亡率为 33.3%—66.7% (表 2),并且从死亡龟中重新分离获得摩氏摩根菌; 对照组稚龟均未发病死亡。

选用24种抗生素进行药敏试验, 结果显示3株分离菌对哌拉西林、头孢哌酮、丁胺卡那霉素、庆大霉素、卡那霉素、乙基西梭霉素、诺氟沙星7种抗生素敏感, 对氨苄西林、头孢噻吩、头孢孟多、替考拉宁、阿奇霉素、红霉素、制菌霉素、四环素、萘啶酸、利福平、克林霉素、呋喃妥因、复方新诺明、洁霉素 14种抗生素耐药; 此外, 病灶分离株TMM13032对氯霉素、磺胺异恶唑、甲氧苄啶3种抗生素敏感, 而TMM13033、TMM13034菌株耐药(表3)。

表1 三株分离菌株的生化反应结果Tab. 1 The biochemical reaction results of the three isolates

表2 三株分离菌的动物感染试验结果Tab. 2 Results of animal infection test of the three isolates

3 讨论

摩氏摩根菌(Morganella morganii)为肠杆菌科细菌,广泛分布于水、土壤及人和动物粪便中, 是引起严重感染的条件致病菌之一, 主要引起人尿路感染和术后伤口感染。目前, 关于摩氏摩根菌对水生动物的致病机制研究,尚未见相关文献报道。Chen等从术后感染败血症病人血液中分离到摩氏摩根菌[8]。Zhao等从病鸡肝脏组织及分泌物中分离病原菌, 通过生化特性、16S rDNA序列分析确定为摩氏摩根菌[9]。赵耘等从患病袋鼠肺脏中分离到3株摩氏摩根菌, 其 16S rDNA 基因序列与模式株LMG7874同源性为 99.8%[10]。研究表明, 摩氏摩根菌可引起多种养殖水生动物感染发病, 是水生动物重要病原菌之一。孔蕾等从中华鳖疖疮病灶及内脏中分离到摩氏摩根菌, 通过稚鳖感染试验证实该菌具有较强致病性[11]。黎小正等从发病黄喉拟水龟肝、肺中分离到摩氏摩根菌, 通过动物感染试验确定为病原菌[3]。本研究从发病黄喉拟水龟体表及内脏中分离到摩氏摩根菌(M. morganii), 这与摩氏摩根菌感染引起龟死亡的相关报道基本一致[3,11]。

近年来, 水生病原菌耐药性不断增强, 进一步增加了临床治疗难度。本试验对分离菌进行药敏试验, 旨在筛选有效治疗药物, 结果显示3株摩氏摩根菌对哌拉西林、头孢哌酮、丁胺卡那霉素、庆大霉素、卡那霉素等抗生素高度敏感。孔蕾等进行中华鳖摩氏摩根菌药敏试验, 证实对氨曲南、氟苯尼考、头孢哌酮等药物敏感[11]。Zhao等发现鸡源摩氏摩根菌对头孢哌酮、新霉素、诺氟沙星、链霉素等抗生素敏感[9]。此外, 研究表明摩氏摩根菌对多种常用抗生素存在耐药性, 因此在水产养殖过程中要慎选药物、合理用药, 其中头孢哌酮、诺氟沙星等抗生素是治疗摩氏摩根菌感染的首选药物, 为水生动物细菌性疾病预防和治疗提供科学参考。

图4 三株分离菌的系统进化树分析Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of the three isolates

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ISOLATION, IDENTIFICATION AND ANTIBIOTIC SENSITIVITY TEST OF MORGANELLA MORGANII FROM MAUREMYS MUTICA

LAN Yun, HU Xiu-Cai, LÜ Ai-Jun, SHEN Xiao-Jing, ZHU Ai-Hua and FENG Zhao-Jun
(School of Life Sciences, Jiangsu Normal University, Xuzhou 221116, China)

黄喉拟水龟; 摩氏摩根菌; 分离鉴定; 致病性; 药敏试验

Mauremys mutica; Morganella morganii; Isoltation and identification; Pathogenicity; Antibiotic sensitivity test

S947.9

A

1000-3207(2014)06-1173-06

10.7541/2014.170

2013-09-22;

2014-03-02

国家自然科学基金(31272692、30800847); 江苏省“青蓝工程”(2014)资助

兰云(1987—), 女, 江苏连云港人; 硕士研究生; 主要从事微生物及免疫学研究。E-mail: lanyun9058@126.com

吕爱军(1973—), E-mail: lajand@126.com