奥美拉唑对大鼠反流性食管黏膜损伤后细胞增殖相关基因表达的影响

张萌 黄刚 周志刚 杨金良

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是指胃、肠内容物反流至食管引起的各种症状或食管黏膜组织损伤，是胃肠道的常见疾病之一。反流可引起烧心、反酸、胸痛甚至哮喘、咳嗽等症状，易长期反复发作且治疗效果欠佳，严重影响患者的生活质量。临床研究表明，奥美拉唑对反流性食管炎(RE)有一定的疗效［1－3］，但对其作用机制报道较少。本研究应用反流性食管黏膜损伤大鼠模型，观察了奥美拉唑对反流食管黏膜损伤的作用，同时观察了其对增殖细胞核抗原(PCNA)、肿瘤抑制基因(p21)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cylin-dependentkinases，CDK)4表达的影响，进一步探讨了其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组 健康雄性SD大鼠75只，体重220～250 g，由河北省实验动物中心提供。大鼠购入后适应环境1周，分笼饲养，自由进食标准饲料及饮水。随机将大鼠分为5组:假手术组、胃食管反流动物模型组(模型组)、奥美拉唑低、中、高剂量组，每组15只。

1.2 模型制备及给药 术前大鼠禁食24 h，禁水2 h。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(30 ml/kg)麻醉，采用食管下段与胃底吻合术，上腹部正中切口，于胃大弯侧食管下段(距胃食管交接部0.5～1.5 cm处)和胃底近食管下段处分别做1.0 cm切口行侧侧吻合。假手术组上腹部正中切口，暴露胃食管及十二指肠于腹腔外约10 min后关闭腹腔。于术后第6天分别将奥美拉唑低剂量(10 mg)、中剂量(20 mg)、高剂量(40 mg)给大鼠灌胃，假手术组和模型组大鼠给予等容量的0.9%氯化钠溶液，连续给药8周。取食管下段(包括吻合口)进行纵行剖开，肉眼观察黏膜状况，迅速分为两份，一份放入液氮罐内冰冻保存行免疫组织化学检测。另一份呈条状置于10%中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋，组织切片，HE染色，光镜观察组织学改变。

1.3 免疫组织化学检测 p21，PCNA，CyclinD1，CDK4蛋白表达 各例石蜡包埋组织均取6张切片，4张分别进行蛋白免疫组织化学染色，1张用PBS液代替一抗作为阴性对照，1张备用。用已知阳性切片作为阳性对照。所用载玻片均经多聚赖氨酸处理，连续切片厚4 μm，一抗为小鼠抗人p21单克隆抗体(稀释比例1∶50)，小鼠抗人CDK4单克隆抗体(稀释比例1∶50)、兔抗人CyclinD1单克隆抗体(稀释比例1∶50)、兔抗人PCNA单克隆抗体(稀释比例1∶100)、二抗为生物素化羊抗兔或小鼠 IgG，以0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照，

1.4 免疫组化图像分析 p21、PCNA、CyclinD1、CDK4蛋白表达的免疫组化结果，应用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统分析。p21蛋白的阳性表达分析采用灰度值的方法;选择免疫组化切片，以组织空白处入射光的值定标，每张切片选取6个高倍视野(10×40)，对食管黏膜上皮细胞胞浆区的灰度值进行测量，取平均值作为测定值，每组分析10只动物的切片，随阳性表达强度增加，灰度值减小。

1.5 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管大体形态变化 假手术组大鼠食管颜色淡红，有光泽，黏膜光滑。模型组大鼠食管颜色变淡白，黏膜粗糙、增厚、皱襞灰白色斑块状增生。与模型组比较，奥美拉唑低、中、高剂量治疗组大鼠食管病变明显减轻。

2.2 食管黏膜光镜下形态变化 HE染色显示，假手术组大鼠食管各层结构完整，黏膜厚薄适中，黏膜基底膜清楚，各层细胞排列整齐，表面可见较少的角化。模型组大鼠黏膜层增厚，基底细胞层及棘细胞层细胞数目增多，角化层增厚，局部黏膜基底细胞层明显增生，部分黏膜组织向外呈乳头样突起。与模型组比较，奥美拉唑治疗组大鼠食管黏膜损伤及增生病变明显减轻。见图1～5。

图1 假手术组(HE×100)

图2 模型组(HE×100)

图3 奥美拉唑低剂量组(HE×100)

图4 奥美拉唑中剂量组(HE×100)

图5 奥美拉唑高剂量组(HE×100)

2.3 免疫组织化学检测 p21蛋白的阳性反应定位于细胞质和细胞核，假手术组大鼠食管黏膜有p21蛋白表达，模型组大鼠食管黏膜p21蛋白表达减少，与模型组比较，奥美拉唑治疗组大鼠食管p21蛋白表达显著增强(P＜0.05)。PCNA蛋白的阳性反应定位于细胞核，假手术组大鼠食管基底细胞层有基础阳性表达，与假手术组比较，模型组大鼠食管黏膜阳性细胞表达数及阳性细胞表达率明显升高，阳性细胞的表达也从基底细胞增加至棘细胞层乃至全层，与模型组比较，奥美拉唑治疗组大鼠食管PCNA蛋白表达显著降低(P＜0.05)。CyclinD1蛋白阳性反应定位于细胞胞浆，表现为胞浆内出现棕黄色颗粒或团块，假手术组的基底细胞层及棘细胞层有阳性基础表达，模型组大鼠食管CyclinD1蛋白表达明显增强，与模型组比较，奥美拉唑治疗组大鼠食管CyclinD1蛋白表达显著降低(P＜0.05)。CDK4蛋白阳性反应定位于细胞核及胞浆，表现为胞核黄染和(或)胞浆内出现棕黄色颗粒或团块，假手术组的基底细胞层及棘细胞层有阳性基础表达，模型组大鼠食管CDK4蛋白表达显著增强，与模型组比较，奥美拉唑治疗组大鼠食管CDK4蛋白表达明显降低(P＜0.05)。见表1。

表1 5组相关基因蛋白表达比较n=10，±s

表1 5组相关基因蛋白表达比较n=10，±s

注:与模型组比较，*P ＜0.05

组别 蛋白表达的灰值p21 PCNA CyclinD1 CDK4模型组133±7 19±4 75±6 60±5假手术组 143±10* 131±9* 139±9* 125±8*奥美拉唑低剂量组 114±6* 51±7* 98±7* 71±6*奥美拉唑中剂量组 90±4* 86±8* 120±7* 97±6*奥美拉唑高剂量组 69±4 124±9* 133±8* 122±7*

3 讨论

GERD是由胃内容物反流引起不适和(或)并发症的一种疾病，是影响胃肠道的常见病之一。反流性食管炎(RE)是GERD症状之一［4］。本实验采用胃食管反流手术方式复制反流性食管黏膜损伤的大鼠模型，结果显示，模型动物均出现食管黏膜损伤，黏膜粗糙、增厚、皱襞灰白色斑块状增生，表明模型复制成功。

正常的食管鳞状上皮细胞大多数处于静止状态，反流物对食管黏膜的刺激损伤可导致基底层细胞分化增殖增强，进入活跃的细胞周期，食管上皮乳头延长、基底层细胞增厚等［5］。因而上皮增殖的程度可体现损伤的程度。细胞周期(cell cycle)是细胞生命活动的基本过程，指从细胞分裂结束开始，到下一次细胞分裂结束为止的过程，DNA合成和细胞分裂是细胞周期的两个主要事件。严格有序的细胞周期调控机制可保证细胞生命活动的正常运行。但在许多疾病中，病理刺激导致细胞周期调控机制紊乱，最终导致细胞死亡。目前发现的与细胞周期调控相关的分子主要有5种:细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI)、视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma，Rb)、E2F转录因子。其中CDKs是调控网络的核心，Cyclins对CDKs具有正性调控作用，CKIs有负性调控作用，共同构成了细胞周期调控的分子基础。CyclinD1是G1期细胞周期蛋白的一员，其通过激活周期蛋白依赖性激酶Cdk4和Cdk6来使Rb磷酸化，Rb磷酸化导致E2F释放，随后E2F与其二聚体伙伴(dimerization partner protein，DP)结合形成有功能的异二聚体后，结合到靶基因启动子中特殊的DNA序列上，调节基因转录，促进细胞通过G1/S调控点。PCNA是一种仅在增殖细胞中合成与表达的分子量为36 kD多肽，在DNA复制过程中起作用，它在晚G1期和S期合成，在正常细胞中与Cyclin、CDK及p21组成复合物调节细胞由G1期向S期过度，在DNA的半保留复制过程中起关键作用，在真核生物的细胞周期调控中起重要作用［6，7］。长期静止状态的细胞基本不表达PCNA，处于增殖状态的细胞和肿瘤细胞中PCNA的表达明显增强，因而其表达被认为是评价细胞增殖活性的重要指标及临床评价患者预后的参考［8－10］。细胞周期素(Cyclin)D1及细胞周期素依赖性激酶(CDK)4在多种肿瘤组织中过度表达，且具有促进细胞增殖的作用。Cyclin D1基因是一类在细胞周期中含量呈周期性变化的细胞周期调节蛋白，是细胞周期素依赖性激酶(CDK)的正向调节因子，调节着细胞增殖、分化和死亡的过程。Cyclin D1的过度表达，可导致pRB蛋白的磷酸化修饰提前实现，加速细胞从G1期到S期的转变，并促进细胞DNA的复制过程。p21作为一个广谱的细胞周期依赖性激酶(CDK)抑制剂和细胞周期的负调控因子，具有阻止细胞通过G1/S期“关卡”的作用，从而抑制细胞增殖。

本研究表明，PCNA蛋白的阳性反应定位于细胞核，CyclinD1蛋白阳性反应定位于细胞胞浆，表现为胞浆内出现棕黄色颗粒或团块，CDK4蛋白阳性反应定位于细胞核及胞浆，表现为胞核黄染和(或)胞浆内出现棕黄色颗粒或团块，p21蛋白的阳性反应定位于细胞质和细胞核。正常大鼠食管黏膜有一定的PCNA、CyclinD1、CDK4和p21蛋白阳性表达，反流性食管黏膜损伤后，大鼠食管黏膜PCNA、CyclinD1和CDK4蛋白表达明显增强，p21蛋白阳性表达显著减弱，经奥美拉唑治疗后，大鼠食管黏膜损伤明显减轻，食管黏膜PCNA、CyclinD1和CDK4蛋白表达明显降低，p21蛋白阳性表达显著增强，上述结果提示，奥美拉唑通过下调细胞增殖相关基因PCNA、CyclinD1和CDK4蛋白表达，上调p21蛋白表达，可能是其发挥治疗反流性食管损伤的重要作用机制，其详细机制有待进一步研究。

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