IL－36γ、p38MAPK通路和Th17细胞因子在扁平苔藓中的表达

贺 琪 吴 艳 岳 青 李家文

·论著·

IL－36γ、p38MAPK通路和Th17细胞因子在扁平苔藓中的表达

贺 琪 吴 艳 岳 青 李家文∗

目的: 检测IL－36及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路和Th17细胞因子在扁平苔藓中的表达。方法: 应用Envision免疫组化法检测58例扁平苔藓及19名正常皮肤标本中IL－36γ、磷酸化－p38MAPK(p－p38)和IL－17A的表达。结果: IL－36γ、p－p38和IL－17A在扁平苔藓皮损中的蛋白表达阳性率为86.21%、79.31%和94.83%，显著高于正常对照标本阳性率为68.42%、15.79%和63.16%(均P＜0.01)。扁平苔藓组中，IL－36γ与p－p38、IL－36γ与IL－17A的表达水平存在显著正相关(P＜0.001)，两因子表达强度有显著差异(P＜0.05)。结论: p38MAPK通路和Th17细胞因子可能与扁平苔藓的发病有关。

白细胞介素－36； 扁平苔藓； p38丝裂原活化蛋白激酶； Th17细胞； 白细胞介素－17A

白细胞介素－36(IL－36)细胞因子作为新的IL－1家族成员在近几年的相关研究中逐渐崭露头角。1迄今的研究成果证实，IL－36是一种促炎性细胞因子，能被多种细胞分泌产生，在先天性和获得性免疫应答过程中均发挥重要作用。2丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一个高度保守的信号转导家族，可被多种刺激活化，目前已有ERK途径、JNK途径、p38MAPK途径及ERK5/BMK1途径等经典MAPK信号通路被鉴定出来，当机体受到不同刺激时，相应通路被激活并参与特定的病理过程，产生多种生物学效应。3辅助性T细胞17(Th17)由CD4＋T细胞分化而来，可分泌IL－17A、IL－17F、IL－6和TNF－α等炎性细胞因子，参与多种细胞、因子及信号通路的诱导和调控，在慢性炎症及自身免疫性疾病的发病机制中占有重要地位。4文献揭示，IL－36在银屑病、关节炎、慢性肾炎、呼吸道及肺部感染等多种炎症性疾病中表达升高，参与炎性细胞的趋化和募集，诱导多种炎症介质和细胞因子的产生和释放，并可于体外诱导激活在信号转导过程中占据重要位置的MAPK信号通路与核因子－κB(NF－κB)信号通路。1，2，5本研究应用免疫组织化学方法检测IL－36γ、磷酸化－p38MAPK(p－p38)和IL－17A在扁平苔藓患者皮损组织中的表达，以探讨扁平苔藓中IL－36与p38MAPK信号通路及Th17细胞因子之间的关联和意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 病理组皮损标本取材自2011年1月至2013年5月于我院皮肤科经临床病理确诊的门诊患者，58例扁平苔藓患者，男38例，女20例，年龄24～58岁，平均38.4±8.9岁；所有患者均未患其他皮肤疾病，活检取材前1个月内未行系统治疗，2周内未行局部治疗。对照组标本取材自我院泌尿外科行包皮环切手术的19名健康男性，年龄14～35岁，平均19.2±4.8岁，标本经组织病理学检查确认为正常皮肤。本研究已经过我院伦理委员会批准，患者皆已签署知情同意书。

1.2 试剂 IL－36γ兔多克隆抗体购自美国Gene Tex公司，磷酸化p38 MAPK小鼠单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，IL－17A兔多克隆抗体购自美国Proteintech Group公司，Envision K5007免疫组化试剂盒购自丹麦Dako公司。

1.3 方法 将新鲜标本用10%福尔马林固定后进行石蜡包埋，切片。应用Envision免疫组织化学染色法，将切片脱蜡至水；微波修复抗原；放入3%过氧化氢溶液室温孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶；加入一抗(IL－36γ、p－p38和IL－17A的稀释浓度分别为1∶400、11∶300和11∶50)4℃过夜；PBS洗净后加入相应二抗4℃孵育50 min；PBS洗净后加入新鲜配制的DAB溶液，显微镜控制显色；苏木素复染；脱水封片。空白对照标本以PBS溶液代替一抗。

1.4 结果判定 胞核或胞质内出现黄色或棕黄色染色颗粒的细胞为阳性细胞，p－p38主要定位于胞核，IL－36γ和IL－17A则为胞浆表达。阴性对照为无染色或与背景色一致。应用半定量积分法评估实验结果。每个标本任选10个400倍视野，计算阳性细胞数占视野中总细胞数的比值，取平均值作为该标本的阳性细胞百分比。按阳性细胞百分比评分:＜5%计0分，6%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分。按染色强度评分:无染色计0分，淡黄色计1分，黄色计2分，棕黄色计3分；将上述两项的乘积作为每个标本的总评分，0～1分为阴性(－)，2～4分为弱阳性(＋)，5～8分为阳性(2＋)，9～12分为强阳性(3＋)。

1.5 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件包进行统计学分析，两组间比较应用χ2检验，两因子间的相关性分析应用spearman等级相关法。P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 IL－36γ、p－p38和IL－17A的表达情况 扁平苔藓组中，IL－36γ阳性率86.21%，主要表达于表皮细胞的胞浆中，多聚集在基底细胞液化变性区及周围棘细胞层；p－p38阳性率79.31%，主要分布于颗粒层角质形成细胞及真皮炎性细胞的胞核与胞浆中，染色较浓；IL－17A阳性率94.83%，广泛表达于表皮细胞胞浆、胞外间隙及临近的真皮结缔组织中，染色深。正常对照组中，IL－36γ阳性率为68.42%和IL－17A阳性率为63.16%。在标本中的分布情况与病理组相似，但阳性细胞数量和染色强度相应减少，p－p38阳性率15.79%则在正常表皮中表达极少(图1、2)。IL－36γ、p－p38和IL－17A在扁平苔藓组中的蛋白表达水平均显著高于对照组(χ2＝14.546，P＜0.01；χ2＝28.002，P＜0.001；χ2＝25.024，P＜0.001)，见表1。

图1 a、b、c:IL－36γ，p－p38和IL－17A在扁平苔藓中的表达(免疫组化，×200)图2 a、b、c:IL－36γ，p－p38和IL－17A在正常表皮中的表达(免疫组化，×200)

表1 IL－36γ、p－p38和IL－17A在扁平苔藓和正常表皮中的表达

2.2 IL－36γ与p－p38和IL－17A之间的相关性分析对实验数据的统计学分析显示，在扁平苔藓组中，IL－36γ与p－p38的蛋白表达存在显著正相关(r＝0.655，P＜0.001)，两因子的表达强度有统计学差异(Z＝3.336，P＜0.05)，IL－36γ以阳性为主，p－p38倾向于阳性和强阳性染色。IL－36γ与IL－17A的表达亦呈显著正相关(r＝0.637，P＜0.001；表2)，两因子的表达强度有明显差异(Z＝5.633，P＜0.05)，IL－17A以阳性和强阳性为主。

表2 扁平苔藓组中IL－36γ与p－p38和IL－17A的蛋白表达相关性

3 讨论

IL－1家族的新晋成员IL－36是最初作为促炎症因子被发现并报道，6它包含三个分子，分别是IL－36α、IL－36β和IL－36γ(亦被称为IL－1F6、IL－1F8和IL－1F9)，因其高度同源性而具有相似的生物学活性。1有研究揭示IL－36因子在人类表皮中广泛表达，IL－36α在皮肤角质形成细胞中过表达可导致皮肤炎症，而在IL－36受体拮抗剂(IL－36Ra)天然缺乏时炎症加剧。7本研究结果显示，IL－36γ存在于大部分扁平苔藓标本的皮损表皮中，蛋白表达水平较正常组织显著升高，说明扁平苔藓的发病与IL－36的表达改变密切相关，为该因子与炎症性疾病的关联提供了新的实验依据。

MAPK广泛存在于哺乳动物细胞内，目前已被鉴定出来的经典MAPK胞外刺激信号转导通路中，p38 MAPK通路与细胞的增殖、分化和细胞因子合成相关，并参与T细胞的激活，在光老化、增生性瘢痕、银屑病、黑素瘤及尖锐湿疣等多种皮肤病的局部炎症反应中发挥重要作用，当受到胞外刺激时，p38 MAPK以三级激酶级联模式活化后被磷酸化并转移入胞核，通过其特有通路介导相应的生物学功能。8在本研究中，我们检测到p－p38蛋白在较多扁平苔藓标本中表达，具有亲核性，且染色较深，而在正常对照标本中则表达极少或不表达，证明p38MAPK在扁平苔藓皮损组织中被活化，转变成p－p38，可能因此而激活p38 MAPK通路，参与局部炎症进程。

文献报道，Th17细胞的主要分泌产物IL－17与系统性硬化症、哮喘、银屑病及类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的炎症浸润密切相关，IL－17 mRNA在口腔扁平苔藓患者的皮损黏膜及黏膜下结缔组织中表达升高，推测其与口腔扁平苔藓的病程进展有关。9本研究所收集的扁平苔藓皮损标本均取自体表非黏膜区，实验检测到，IL－17A在几乎所有的组织病理标本中广泛表达，含量显著高于正常对照组，这提示IL－17与非黏膜扁平苔藓皮损的发病亦存在关联。

Towne等人证明，IL－36家族的几种因子可在体外培养的Jurkat细胞中构成一个相对独立的信号系统，并能诱导激活MAPK信号通路。6Carrier等人发现，体外培养的人类角质形成细胞中，IL－36可被以IL－17A和TNF－α为主的Th17细胞因子所诱导，反之亦然。10我们以往的研究结果显示，寻常型银屑病患者皮损中IL－36可诱导p38MAPK通路活化。11本研究通过对实验结果的统计学分析发现，扁平苔藓患者皮损中，IL－36γ与p－p38和IL－17A的表达水平均存在显著正相关，证明IL－36在该病中与p38MAPK通路及Th17细胞因子密切相关，三者可能在局部免疫应答网络中存在相互诱导的关系。针对近几年的研究成果推测，扁平苔藓的发病可能是一种体内外刺激所致的由细胞介导的对角质形成细胞自身抗原的应答改变。12通过对标本切片的镜下观察发现，IL－36γ集中表达于液化变性的基底细胞层及临近表皮，pp38和IL－17A则倾向表达于邻近基底层液化变性区的真皮炎性细胞带，这提示扁平苔藓的主要炎症应答位于表皮基底细胞层及邻近区域，IL－36γ、p－p38及IL－17A趋向患者皮损基底层的这种变化和相互影响可能促使角质形成细胞表达自身抗原，诱发或加剧炎症反应，继而导致角质形成细胞凋亡，基底层液化变性，最终致使疾病的发生和发展。

本研究首次探讨了IL－36在扁平苔藓中的表达情况及其与p－p38和IL－17A的关联，结果提示IL－36因子、MAPK信号通路和Th17细胞在该病的局部免疫应答中均扮演重要角色，且存在复杂的相互影响，三者协同作用于该病的发生及病程进展，这为扁平苔藓的治疗和预后提供了新的思路，其具体病理机制、相互作用及临床意义则有待进一步研究探索。

参考文献

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3Wuertz K，Vo N，Kletsas D，et al.Inflammatory and catabolic signalling in intervertebral discs:the roles of NF－κB and MAP kinases.Eur Cell Mater，2012，16(23):103－120.

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11 He Q，Chen HX，LiW，et al.IL－36 cytokine expression and its relationship with p38 MAPK and NF－κB pathways in psoriasis vulgaris skin lesions.JHuazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2013，33(4):594－599.

12 Nico MM，Fernandes JD，Lourenço SV.Oral lichen planus.An Bras Dermatol，2011，86(4):633－643.

(收稿:2013－12－24 修回:2014－02－05)

Expression of IL－36 and p38MAPK pathway and Th17 cytokine in lichen planus

HE Qi，WU Yan，YUE Qing，et al.Department of Dermatology，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan，430022

Objective:To detect the expression of IL－36，p38mitogen－activated protein kinase(p－p38) pathway and Th17 cytokine in lichen planus.Methods:Immunohistochemistry EnVision technique was used to detect the expression of IL－36γ，p－p38 and IL－17A in 58 patients with lichen planus and 19 controls.Results:The expression of IL－36γ，p－p38 and IL－17A was higher in the patients’lesion of lichen planus(the positive rateswere 86.21%，79.31%and 94.83%)than in control group(the positive rates were 68.42%，15.79%and 63.16%)(all P＜0.01).In lichen planus group，therewere positive correlations between the expression of IL－36γand p－p38(P＜0.001)，and between the expression of IL－36γand IL－17A(P＜0.001). Significant differencewas also observed between the two cytokines’expression grade(P＜0.05).Conclusion: p38MAPK pathway and Th17 cytokinemay be involved in the pathogenesis of lichen planus.

interleukin－36；lichen planus；p38 mitogen－activated protein kinase；Th17；interleukin－17A

国家自然科学基金项目资助(编号:30972654)

华中科技大学同济医学院附属协和医院皮肤科，武汉，430022

∗通信作者