益心舒胶囊对阿霉素致心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响

沈启明，马丽红，王少霞，李 杨，张瑞华

心力衰竭（HF）是各种心脏疾患的终末状态，也是心脏病患者死亡的主要原因。仅2008年在美国，HF的直接或间接治疗费用大约为350亿美元［1］。抑制心肌细胞凋亡能减轻心脏重构和衰竭的程度［2，3］。益心舒胶囊具有益气复脉、活血化瘀、养阴生津的功效，临床研究表明［4］，益心舒胶囊不仅能扩血管，改善心肌血液供应和心肌代谢的作用，而且还有增强心肌收缩力和改善左心功能的疗效。为进一步探讨其作用机制，本实验拟通过对阿霉素（ADR）致HF大鼠模型进行药物干预，探讨益心舒胶囊对HF大鼠心肌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康雄性SD大鼠48只，清洁级，体重（200±20）g，军事医学科学院动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK-（军2007-004）。用随机数表法将48只大鼠随机分为4组：正常对照组、模型组、益心舒组及厄贝沙坦组，每组12只。

1.2 药物及试剂 ADR：深圳万乐药业有限公司（产品批号：1103E2，10 mg／瓶）。益心舒胶囊：贵州信邦制药股份有限公司提供（产品批号：20120107）。厄贝沙坦（irbesartan，Irb）：杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司（批号：1A255，规格：0.15 g）。原位末端转移酶标记（TUNEL）试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司；DAB显色剂：北京中杉金桥生物技术有限公司生产；鼠抗Bcl-2 IgG及鼠抗Bax IgG：美国Santa Cruz公司生产。其他化学分析试剂均为分析纯。

1.3 仪器设备 RM2135病理切片机（德国Leica）；CMIAS-Ⅱ图像分析仪（北京航空航天大学图像中心）；80-2电动离心机（金坛高科仪器厂）。

1.4 方法

1.4.1 模型建立 将注射用ADR用生理盐水配成2 mg／m L溶液，参照周岩等［5］方法建立，36只造模大鼠均腹腔注射ADR 2.5 mg／kg，每周一次，持续6周，复制大鼠HF模型；另12只正常组大鼠腹腔注射等量的生理盐水。模型成功判定标准：病理学观察，6周时造模各组随机选取其中1只做病理检测以确定模型是否成功。光学显微镜下观察心肌组织。超声心动图检查，于第6周末对模型组及正常对照组大鼠用水合氯醛麻醉后行超声心动图检查，记录大鼠左室舒张期末径（LVEDD）、收缩期末径（LVESD）、左室射血分数（LVEF）及左室短轴缩短率（FS），正常组与模型组有统计学意义。综合病理学观察和超声心动图检查结果，判定模型取得了成功。

1.4.2 给药 从大鼠注射ADR第6周开始灌胃给药。益心舒组：将益心舒除去外层胶囊用蒸馏水配成混悬液，按人与大鼠体表面积折算为大鼠灌胃剂量，相当于临床成人的正常剂量，为320 mg／（kg·d）；厄贝沙坦组剂量也折算为相应的成人正常剂量，为50 mg／（kg·d）；正常组和模型组大鼠予以与益心舒组等量生理盐水，每天上午灌胃一次，连续给药28 d。

1.4.3 指标检测 末次给药后禁食水12 h，以5%水合氯醛按4 ml／kg麻醉后称重，取左室心肌部分绿豆大小组织浸泡于10%甲醛溶液中留待做病理检查。光镜下（10×20）进行病理学观察。心肌细胞凋亡检测。心肌细胞Bcl-2、Bax蛋白检测，采用免疫组化法结合图像分析半定量测定。

1.5 统计学处理 采用SPSS19.0软件处理，计量资料以均数±标准差±s）表示，组间比较采用单因素方差分析法，两两比较采用LSD检验法。以P＜0.05差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 造模过程中正常组大鼠毛色有光泽，行动敏捷，对周围变化反应灵敏；其余组大鼠逐渐出现毛色枯槁、散乱竖起，脱毛，懒动，少食，腹泻，口唇紫绀等症状体征，体重逐渐下降，第4周开始部分大鼠出现腹水和死亡，其中模型组死亡1只，益心舒组死亡1只，到第8周实验结束时，正常组全部存活，模型组死亡3只，益心舒组死亡2只，厄贝沙坦组死亡2只。死亡大鼠解剖发现：腹水量较大，呈粉红色浑浊样，肝脾明显增大，边缘圆钝，质地变硬，脏器粘连明显；心脏增大，双肺明显淤血，其中1只有胸水。

2.2 病理学观察 光学显微镜下观察心肌组织，正常组心肌细胞形态正常，纹理清晰，无纤维增生；模型组可见心肌纤维改变，嗜酸性变性，坏死，间质纤维化等，程度上多为中度以下；益心舒组虽然可见心肌空泡变性和心肌纤维化等改变，但均为轻微改变。厄贝沙坦组心肌改变也主要表现心肌空泡变性和嗜酸性变性，个别动物空泡变性较重，与益心舒组无明显差别。提示经益心舒治疗后，大鼠心肌细胞损伤状况得到明显改善。

2.3 各组心肌细胞凋亡情况及凋亡率比较（见表1） 正常组大鼠心肌切片偶尔可见凋亡细胞；模型组大鼠心肌细胞凋亡严重，呈孤立、散在分布，棕褐色胞核数量明显增多。与正常组相比，模型组的细胞凋亡率明显升高（P＜0.01）；与模型组相比，益心舒组及厄贝沙坦组凋亡细胞数量明显减少，凋亡率明显下降（P＜0.01）；益心舒组与厄贝沙坦组比较无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠心肌细胞凋亡率±s） %

表1 各组大鼠心肌细胞凋亡率±s） %

组别 n 细胞总数 凋亡率正常组5 500 3.50±0.46模型组 5 500 17.12±1.991）益心舒组 5 500 11.41±2.052）厄贝沙坦组 5 500 10.54±2.072）与正常组比较，1）P＜0．01；与模型组比较，2）P＜0.01

2.4 各组Bcl-2、Bax表达水平及Bcl-2／Bax比较（见表2） 与正常组比较，模型组Bax蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表达水平及Bcl-2／Bax显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，益心舒组及厄贝沙坦组Bcl-2蛋白表达水平均明显升高，Bax蛋白表达水平均明显降低（P＜0.01）。

表2 各组大鼠Bax、Bcl-2蛋白表达及Bcl-2／Bax比较±s）

表2 各组大鼠Bax、Bcl-2蛋白表达及Bcl-2／Bax比较±s）

组别 Bcl-2（%） Bax（%） Bcl-2／Bax正常组 0.182±0.015 0.044±0.011 4.383±1.210模型组 0.072±0.0161） 0.188±0.0111） 0.383±0.0861）益心舒组 0.106±0.0152） 0.124±0.0112） 0.854±0.092厄贝沙坦组 0.110±0.0192） 0.102±0.0222） 1.121±0.325与正常组比较，1）P＜0．01；与模型组比较，2）P＜0.01

3 讨 论

本实验采用近年来比较成熟的ADR腹腔注射方法来制造大鼠HF模型，ADR是一种常用的抗肿瘤药物，对心肌有着特殊的亲和力，可引起类似扩张型心肌病样改变以及在此基础上发生的HF。其机制主要是通过心肌脂质过氧化损伤，抑制心肌肌浆网Ca2＋-ATP酶活性，并激活心肌局部肾素-血管紧张素系统，使血管紧张素Ⅱ生成增多，从而导致细胞内钙超载来实现的［6，7］。近年来有研究表明［8，9］，在 ADR 致 HF的过程中，细胞凋亡起到了重要作用，即使暴露在低于微摩尔浓度ADR中的心肌细胞也会发生细胞凋亡。本实验表明：采用ADR2.5 mg／kg腹腔注射每周一次持续6周的造模方法是成功的，这与文献［10］结果一致。20世纪90年代以来，人们逐渐明确心室重塑是HF发生发展的分子细胞学基础，1996年Narula等［11］率先证实，在HF晚期心肌中存在着细胞凋亡。而心肌细胞凋亡与心室重塑密切相关，是引起心肌细胞缺失的重要机制，在HF由代偿向失代偿转变的过程中起着关键作用［12，13］。HF发生时左室功能的不断恶化是心肌细胞凋亡或（和）剩余的心肌细胞收缩功能代偿不足的结果，随着心肌细胞凋亡使心肌细胞大量丧失，进而细胞肥大、纤维化增生，当细胞数量减少到一定程度必然会导致HF进行性恶化［14］。Abdelwahid等［15］研究指出，心肌细胞凋亡在心室重构以及HF的发生发展中起着重要作用，是HF发生的重要机制。本实验发现，实验各组均可见典型的细胞凋亡形态，但检测各组大鼠的细胞凋亡指数后发现，与正常组相比，模型组细胞凋亡指数明显升高（P＜0.01）；与模型组相比，益心舒组和厄贝沙坦组细胞凋亡指数明显下降（P＜0.01）。提示在ADR致大鼠HF过程中伴随有大量心肌细胞凋亡，中西医治疗均能明显抑制大鼠心肌细胞凋亡，进而延缓HF发展，两者的作用接近。

细胞凋亡是一个十分复杂的过程，其调控涉及许多基因，其中Bcl-2基因家族是目前最受重视也是第一个被发现参与凋亡调控的基因家族，属于一类新的癌基因家族［16］。Bcl-2和Bax同属Bcl-2基因家族成员，在细胞凋亡的调控中起着十分重要的作用，是两种作用相反的基因表达产物：Bc1-2具有抑制心肌细胞凋亡作用，而Bax促进心肌细胞凋亡，两种蛋白表达比率（Bc1-2／Bax）常用以表示心肌细胞凋亡的程度［17］。细胞凋亡时促凋亡基因Bax上调，Bcl-2／Bax比值下降。本实验免疫组化及蛋白半定量测定表明：模型组Bax蛋白表达增强，Bcl-2表达下降，而治疗组Bax蛋白表达下降，Bcl-2表达升高。由此提示：益心舒能明显抑制大鼠心肌细胞凋亡，改善心功能，其作用机制可能与调节Bcl-2、Bax的蛋白表达有关。但值得指出的是：与模型组相比，益心舒组与厄贝沙坦组的Bcl-2／Bax比值无统计学意义（P＞0.05），推测这可能是药物对Bcl-2和Bax的蛋白表达调节不平行导致的。

HF属中医学“心悸”“怔忡”“喘证”“水肿”等范畴，属本虚标实、虚实夹杂之证，本虚为气虚、阳虚，标实为血瘀，水湿。临床上多采用益气养阴、活血化瘀之法。益心舒胶囊源于著名古方生脉散，在人参、麦冬、五味子的基础上，添加了丹参、黄芪、川芎及山楂，具有益气复脉、活血化瘀、养阴生津的功效，临床常用于HF和冠心病心肌梗死的治疗。本实验表明，益心舒胶囊能明显降低HF大鼠心肌细胞凋亡率，下调Bax蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达。推测益心舒胶囊可能是通过调控Bcl-2、Bax蛋白表达而发挥其抑制HF心肌细胞凋亡、改善心功能的作用。而且益心舒胶囊益气活血，临床改善患者心肌供血作用明显，是否还通过其他途径抑制心室重塑，有待于进一步研究探讨。

［1］ Korvald C，Elvenes OP，Myrmel T.Myocardial substrate metabolism influences left ventricular energetics in vivo［J］.Am J Physiol Heart Cire Physiol，2000，278（4）：H1345-H1351.

［2］ Kang PM，Izumo S.Apoptosis and heart failure：A critical review of the literature［J］.Circulation Research，2000，86（11）：1107-1113.

［3］ Garg S，Narula J，Chandrashekhar Y.Apoptosis and heart failure：Clinical relevance and therapeutic target［J］.J Mol Cell Cardiol，2005，38（1）：73-79.

［4］ 魏玲玲.益心舒胶囊治疗糖尿病性冠心病的临床观察 ［J］.中国中西医结合杂志，2008，28（4）：2.

［5］ 周岩，赵丽蓉，杨思睿.阿霉素诱导大鼠扩张型心肌病模型的建立［J］.中国实验诊断学，2010，14（3）：4.

［6］ Nithipongvanitch R，Ittarat W，Cole MP，et al．Mitochondrial and nuclear p53 localization in cardiomyocytes：Redox modulation by doxorubicin（Adriamycin）［J］.Antioxidants Redox Signal，2007，9（7）：1001-1008.

［7］ Berthiaume JM，Wallace KB.Adriamycin-induced oxidative mitochondrial cardiotoxicity［J］.Cell Biol Toxicol，2007，23（1）：15-25.

［8］ Spagnuolo RD，Recalcati S，Tacchini L，et al．Role of hypoxia-inducible factors in the dexrazoxane-mediated protection of cardiomyocytes from doxorubicin-induced toxicity［J］.Br J Pharmacol，2011，163（2）：299-312.

［9］ Kalyanaraman B，Joseph J，Kalivendi S，et al．Doxorubicin-induced apoptosis：Implications in cardiotoxicity ［J］.Mol Cell Biolchem，2002，234-235（1-2）：119-124.

［10］ Hayward R，Hydock D S.Doxorubicin cardiotoxicity in the rat：An in vivo characterization［J］.J Am Assoc Lab Anim Sci，2007，46（4）：20-32.

［11］ Narula J，Haider N，Virmani R，et al．Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure［J］.N Eng J Med，1996，335（16）：1182-118

［12］ Kang P M，Izumo S.Apoptosis in heart：Basic mechanisms and implications in cardiovascular diseases［J］.Trends Mol Med，2003，9（4）：177-182.

［13］ Kang PM，Haunstetter A，Aoki H，et al．Morphological and molecular characterization of adult cardiomyocyte apoptosis during hypoxia and reoxygenation ［J］.Circulation Research，2000，87（2）：118-125.

［14］ Gaballa M A，Goldman S.Ventricular remodeling in heart failure［J］.J Card Fail，2002，8（6 Suppl）：S476-485.

［15］ Abdelwahid E，Smith G.Apoptosis in chronic heart failure［J］.Int J Cardiol，2007，114（3）：375.

［16］ Green DR，Kroemer G.The pathophysiology of mitochondrial cell death［J］.Science，2004，305（5684）：626-629.

［17］ Dong JW，Zhu HF，Zhu WZ，et al．Intermittent hypoxia attenuates ischemia／reperfusion induced apoptosis in cardiac myocytes via regulating Bcl-2／Bax expression［J］.Cell RES，2003，13（5）：385-391.