鼻咽癌患者外周血淋巴细胞中EB病毒DNA载量与临床分期的关系研究

杨雀飞，何彪，谭贵海

(高州市人民医院检验科,广东 高州525200)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种好发于鼻咽部头颈的恶性肿瘤，在我国南方最为常见，其发病率约为30～50/10万[1]。有大量研究发现，绝大多数鼻咽癌患者癌细胞中均存在EB(Epstein-Barr virus，EBV)病毒，在鼻咽癌患者外周血淋巴细胞中可以检测到游离的EB病毒DNA，说明鼻咽癌的发病与EB病毒感染和发展有密切关联[2，3]。近年应用分子杂交及聚合酶链反应(PCR)技术检测亦证实EB病毒在鼻咽癌发展中的重要作用[4，5]。EB病毒DNA载量与鼻咽癌发生发展有什么样的联系一直以来是人们所关注和研究的课题之一，本文定量检测鼻咽癌患者外周血淋巴细胞中EB病毒DNA载量，为鼻咽癌患者临床分期提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年1月至2013年1月我院肿瘤科收治住院的87例鼻咽癌患者，全部患者均经病理活检确诊为鼻咽癌。其中男性49例，女性38例；年龄26~82岁，平均年龄54岁。依据92福州分期标准 (1992年在福州召开的全国肿瘤与放射学术会议)进行分期，其中Ⅰ期23例(26.4%)、Ⅱ期 18 例(20.7%)、Ⅲ期 26 例(29.9%)和Ⅳ期20例(23.0%)。

1.2 仪器与试剂 5个由低浓度到高浓度的EB病毒DNA阳性细胞株作为标准品均购买于中南大学肿瘤研究所，实时荧光定量PCR仪为ABI公司产品，PCR相关试剂及淋巴细胞分离液购自中山大学达安基因股份有限公司。

1.3 标本处理 首先，采集87例患者外周血标本2mL存于EDTA-Na2抗凝管中，然后，在无菌的塑料离心管中加入2ml淋巴细胞分离液，将血液进行1:1稀释后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的离心管中，1500r/min，15min，进行离心。用长嘴胶头滴管吸取分离液层中的淋巴细胞(第二层)，把吸取的淋巴细胞溶液装入另一无菌离心管中加入5ml PBS洗涤，1500r/min,经离心10min后，去掉上层液体，保留离心管底的若干白色物质，即淋巴细胞；再加入等体积Tris-EDTA裂解液和蛋白酶K，37℃水浴1 h，高速离心后取上清，经酚-氯仿抽提，乙醇沉淀清洗得到DNA模板[6]，以 EB病毒DNA为模板进行扩增检测。

1.4 实验方法 采用实时荧光定量PCR技术对淋巴细胞中EB病毒游离DNA进行定量测定。反应条件为 93℃ 3min，93℃ 45s， 55℃ 2min， 共 40 个循环。反应结束后，用计算机将样本和标准曲线对比，计算出反应体系中待测标本中DNA的拷贝数。PCR反应总体积为50μl，含l0μl PCR缓冲液，引物和对应的荧光标记探针各 10pmol。dATP、dCTP、dGTP 和 dUTP 各 200 μmol／L，Tap 聚合酶5U，DNA 模板 5μl， 吸取抽提的 DNA 5μl入 PCR的反应管中，在ABI7300自动荧光PCR仪上进行扩增。阳性标准定义为：DNA水平>1×103拷贝/m l判断为阳性；阴性标准定义为：DNA≤1×103拷贝/ml判断为阴性。

1.5 统计学处理 采用SPSS18.0软件进行统计学分析。计数资料采用χ2检验。计量资料采用 x±s表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽癌患者外周血淋巴细胞中EB病毒DNA检测 以EB病毒DNA标准品进行定量，计算不同患者外周血淋巴细胞中EB病毒DNA的拷贝数及中位数。结果显示，鼻咽癌患者淋巴细胞中EB病毒DNA的阳性率为82.76%(72/87)，中位数为7.58×106拷贝数/ml，经 χ2检验分析，不同临床分期鼻咽癌患者中EB病毒DNA定量测定比较有统计学差异(P<0.05)，结果见表1。

2.2 不同分期鼻咽癌患者EB病毒的含量有明显差异 87例鼻咽癌患者检测EB病毒DNA载量中，Ⅰ期23例、Ⅱ期18例、Ⅲ期26例、Ⅳ期20例的鼻咽癌患者DNA拷贝数平均数分别为 (4.25±1.14)×103，(4.56±0.68)×104，(7.88±1.65)×105，(8.09±1.65)×106。 对不同组间进行 t检验，P<0.05或 P<0.01结果有统计学差异，结果见表2。

表1 不同临床分期鼻咽癌患者中EB病毒DNA定量测定比较

表2 鼻咽癌患者DNA拷贝数

3 讨论

鼻咽癌是一种与EB病毒非常密切的恶性肿瘤，有学者认为在鼻咽癌的发生发展中，EB病毒感染淋巴细胞是感染及致病的重要机制[7]。而在目前临床应用广泛的EB病毒血清标志物检测指标中，EB病毒DNA定量测定应用对鼻咽癌的诊断及预后的预测有着很大的优势[8，9]。本文资料显示，采用实时荧光定量PCR法对我院87例鼻咽癌患者外周血淋巴细胞EB病毒DNA含量检测，结果发现鼻咽癌患者的阳性率为82.76%(72/87)，说明外周血淋巴细胞中EB病毒检测在鼻咽癌辅助诊断中具有极高价值。然而，有研究分析[10]EB病毒感染鼻咽组织是普遍现象，且感染发生在癌变前，由于EBV存在F和f两种亚型，故检出阳性率不可能达到100%。

鼻咽癌临床分期指导下的个体化综合治疗已成为肿瘤治疗的规范。鼻咽癌治疗疗效在一定程度上决定于鼻咽癌所处临床分期，Ⅰ-Ⅳ期5年生存率分别为92.38%、79.64%、62.31%和40.16%，鼻咽癌的临床分期在鼻咽癌治疗中起重要作用[11]。研究发现鼻咽癌患者淋巴细胞中存在大量游离的EB病毒DNA，并发现EB病毒DNA随着肿瘤消长而变化，鼻咽癌患者EB病毒DNA检测在鼻咽癌治疗评价中的重要性已得到普遍认可，然而外周血淋巴细胞中EB病毒DNA在初诊鼻咽癌临床分期中的作用仍不十分清楚。

为进一步明确鼻咽癌患者外周血淋巴细胞中EB病毒DNA鼻咽癌患者临床分期的关系，本实验对比分析了鼻咽癌患者EB病毒DNA与所处临床分期的关系，以明确EB病毒DNA在鼻咽癌临床分期中的价值。本实验采用实时荧光定量PCR法检测EB病毒DNA载量，分析外周血淋巴细胞中EB病毒DNA载量与鼻咽癌患者临床分期关系。结果显示EB病毒DNA载量与鼻咽癌临床分期密切相关，即随Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分期的递增，EB病毒DNA拷贝数越高，这与相关报道相同[12]。Ⅲ、Ⅳ期EB病毒DNA拷贝数明显高于Ⅰ、Ⅱ期的，即临床分期越晚，患者淋巴细胞中EB病毒DNA载量越高,外周血淋巴细胞中EB病毒游离DNA拷贝数与鼻咽癌分期相一致，很好地反映了鼻咽癌临床特征，EB游离DNA拷贝数与患者体内肿瘤负荷呈正相关，提示EB病毒DNA载量与鼻咽癌病情进展密切相关，可作为病情监测及判断疗效的一种有效手段。

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