14例人乳头状瘤病毒16型E7基因结构和变异分析

王长奇，杨志华，罗娜，陈燕萍，周开良

(江西萍矿总医院检验科，江西 萍乡337000)

人乳头瘤病毒 (human papillomavious，HPV)为小的双链DNA病毒，其中高危型HPV是生殖道恶性肿瘤的危险因素，与宫颈癌的发生有着密切关系[1]，尤以HPVl6型感染率最高，约50%的宫颈癌患者肿瘤组织的DNA为HPVl6型[2，3]，而 HPV早期基因E6 E7的表达在细胞癌变过程和维持细胞恶性表型方面起着重要作用。为了分析研究江西地区HPVl6感染的基本情况，我们从宫颈组织中分离、克隆了HPVl6 E7基因，进行序列测定，并与网上发表的毒株比较，发现江西地方株与标准株(德国)及其他地区分离株之间存在一些变异。该株的获得，将丰富我国HPVl6感染的流行病学资料，为HPV疫苗的开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象 采用住院病人，共14人；年龄在32~78岁之间；平均年龄55岁。所有病例来自赣州6例，鹰谭1例，南昌市内3例，九江2例，萍乡2例。病理学诊断：鳞癌6例，CINⅢ 6例，CINⅡ 2例，临床病理资料于病理科获得。同时采用5例宫颈脱落细胞学检查 形态无异常、HPV检测阴性标本为对照。

1.2 试剂及仪器 Taq聚合酶、限制性内切酶、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)等购自上海生物工程公司，T4DNA连接系统、DNA Marker购自大连宝生物公司，凝胶回收试剂盒购自QIAgen公司。质粒和宿主菌pGEM-Teasy载体购自Promega公司，宿主菌DH5a由比较医学中心保存。DNA提取试剂盒，人乳头瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒及核酸分子杂交仪由潮州凯普生物化学有限公司提供，PCR仪采用ABI公司9700型号。

1.3 标本采集及处理 暴露宫颈,用棉拭子擦去宫颈口多余分泌物,用取样刷置于宫颈口顺时针方向旋转5～6周以获取足量的宫颈脱落上皮细胞。将取样后的宫颈刷放入含有细胞脱洗保存液的加盖微量离心管(1.5ml)中,-22℃冷冻保存，保存时间不超过3个月。标本处理时充分洗脱宫颈刷上样本,留取含脱落宫颈细胞的洗脱液。

1.4 HPV 16亚型的鉴定 按试剂盒说明书进行HPV DNA提取，PCR扩增，核酸分子快速导流杂交，结果判读，按芯片上HPV亚型分布的相应着色点判读，统计出含有16亚型的样本。

1.5 HPV16 E7基因扩增

1.5 .1 E7特异性引物的设计 根据已发表的HPVl6标准株DNA全序列设计，跨HPVl6 E7整个阅读框(562~858)，并包含起始密码子ATG和终止密码子 TAA。 HPVl6 E7特异引物序列(5’-3’)：上游引物：GAATTCAGAACAGCAATACAACAAACC下游引物：CAAGCTTGCAGCCTCTACATAAAACCATC在上下游引物5’端分别设计了EcoRⅠ和HandlⅡ酶切位点。

1.5 .2 E7基因的扩增 用E7特异性引物PCR扩增含有16亚型的样本DNA,反应参数：95℃9min预变性,95℃ 20s,55℃ 30s,72℃,30s,40个循环，72℃，延伸5min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 HPVl6 E7基因的克隆 将PCR扩增的DNA片段经1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶回收试剂盒回收，与pGEM-Teasy载体按常规方法连接、转化宿主菌DH5a，通过蓝白斑和EcoRI、HandlII双酶切筛选阳性克隆。

1.7 HPVl6 E7基因的序列测定 HPVl6 E7基因的序列测定由上海生物工程公司完成。运用DNAMAN软件对测序的E7基因序列进行分析。

2 结果

2.1 HPVl6 E7基因PCR结果 以宫颈癌组织提取的DNA为模板，PCR法扩增目的片段，经1%琼脂糖凝胶电泳后，在约600 bp处可见一清晰条带，与预计片断大小一致。

2．2 HPVl6 E7基因的序列分析 运用DNAStar软件，将获得的地方株HPVl6 E7核苷酸序列与网上公布的德国标准株[4]、E7基因序列进行比较，结果显示地方株在核苷酸水平上与德国标准株有99．7%的同源性。

2.3 测序比对 HPV16 E7变异核苷酸水平上一些位点的变异引起了三联密码子的改变，进而引起氨基酸的变化，另一位点突变虽然改变了三联密码子，并未导致氨基酸水平上的变化。见表1。2.4在HPV16 E7基因核苷酸及氨基酸序列变异中鳞癌有6例 (A647G 4例、A646C 1例、C790T 1例),CINⅢ 6例(A647G 2例、A646C 1例、C790T 1例、T760C 1 例、T843C1 例)，CINⅡ 2 例(A647G1例、T846C1例)。在鳞癌和CINⅢ中12例都有氨基酸错义突变， 以 A647G、A646C、C790T多见，5例阴性对照均未见异常。

表1 E7基因核苷酸及氨基酸序列变异表

3 讨论

大量研究表明，高危型HPV感染是宫颈癌发生的重要原因，特别是HPVl6，约占HPV阳性宫颈癌的50%，HPV早期基因E6、E7的过量表达是诱发宫颈癌的关键所在。E7的C端60个氨基酸中存在 2个“Cys—X—X—Cys”锌指结构，N 端 37个氨基酸与腺病毒E1A和SV40T抗原相似，能与pRb结合使之失去抑癌活性，导致细胞癌变，在肿瘤组织中HPV DNA常整合于细胞基因组不稳定区和转录活跃区，影响这些区域的功能，如HPV DNA整合在13q14，恰好是抑癌基因Rb所在位点[5]。

世界不同国家和地区的学者在对本地区HPVl6E7基因进行克隆和序列分析过程中发现,HPVl6 E7基因较为保守，但各地HPVl6 E7基因之间仍存在一些变异。我国伍欣星报道了湖北地区宫颈癌组织中HPVl6 E7变异株[6]有两处碱基发生了C→T突变，氨基酸序列N端是完整的，c端则由于基因的突变，使所编码的蛋白多肽提前终止；熊金虎报道的湖北不同地区宫颈癌组织中HPVl6 E7变异株[7]，显示武汉地区变异株只有一处碱基突变，氨基酸序列未发生改变，湖北高发区(武峰县)变异株有三处碱基突变，氨基酸序列发生了改变，但湖北地区仍以野生型为主；许雪梅报道[8]的山东地区HPVl6 E6、E7变异株中未发现E7基因突变；马正海报道的新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织中HPVl6 E7碱基序列和氨基酸序列与德国标准株均完全一致[9]。从我们研究来看，HPV16 E7碱基序列和氨基酸序列尤以A647G多见，占50%,错义突变有3处，同义突变有3处,与上述作者报告基本相似。

通过对HPVl6 E7基因序列分析、比较，可以发现HPVl6 E7基因相对保守，但各国各地区流行株之间仍存在差异，本地区HPVl6 E7流行株，有6个碱基突变，鳞癌有6例(4例A647G、1例A646C、1例 C790T),CINⅢ6例 (2例 A647G、1例 A646C、1例 C790T、1例 T760C、1例 T843C)CINⅡ 2例(1例 A647G、1例 T846C)，6例鳞癌和 6例 CINⅢ都有氨基酸错意突变，尤以A647G多见。本文氨基酸序列只有2例与标准株序列完全一致。提示HPVl6 E7基因片段内氨基端变异相对频繁；而A646C C790T突变尚未见大量报道。

HPVl6 E7在核苷酸水平上均存在变异，与国外文献报道一致[10]。而与国内相关文献报道的HPVl6 E7“未发现变异”结论不同。这可能与样本的大小、样本的代表性、病人选择标准、实验设计、检测方法等因素存在差异有关，此外，亦不能除外与这一地区E7基因序列存在多态性有关。地区HPVl6 E7还存在尚未见报道的突变位点，提示这一地区HPVl6变异具有多样性；变异可能会增强其致癌性，提示为致癌预警信息；建议加强PVl6型E7内变异株检查，做好宫颈癌患者致癌预警工作，将为我国HPV基因变异与宫颈癌的关系提供更完善的理论依据。

[1]Das BC，Sharma JK，Gopalkrishna V，et a1．A Frequency of human papillomavirus DNA sequences incervical carcinomas of Indian women as revealed by southern blot hybridization and polymerase chain reaction[J]．JMed Virol 1992,36(4)：239．

[2]张志勇,施桥发.人乳头瘤病毒与宫颈癌关系的研究进展[J].实验与检验医学,2012,30(3):252-256.

[3]王长奇,王康,陈燕萍,等.HPV多重感染与宫颈病变关系的分析[J].实验与检验医学,2012,30(2):166-168.

[4]左亚刚,王家璧,许雪梅,等.北京地区人乳头瘤病毒 HPVFfiE7基因变异和序列分析[J].中华皮肤科杂志,2003;36:650．

[5]Mark HF．Integration of human papillomavirus sequences in cervicaltumor cell lines[J]．Ann Clin Izb Sci,1996,26：147.

[6]伍欣星,赵文先,丁晓华,等.湖北地区宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E7基因的分离、克隆和序列分析[J].中国病毒学,1996,11:220．

[7]熊金虎,伍欣星,谭云.不同地区HPVl6E7基因的克隆及序列差异分析[J]．中国病毒学,2002,17:211.

[8]许雪梅,司静懿,刘世德,等.PRIVATE中国山东地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16E6E7基因的分离、克隆和序列分析．中国医学科学院学报1999;21:185.

[9]高慧,韩秋萍,黄正芳,等.扬州地方株HPV16E7基因的克隆及序列分析.中国麻风皮肤病杂志,2005,21:(6)445.

[10]Paul KSC,ChingWL,Tak HC,et al.Human papillomavirus type 16 Variant infection and risk for cervical neoplasia in southern China[J]．Infet Dis,2002,186(5):696-700．