柯萨奇-腺病毒受体在肺癌组织中的表达及其与临床病理因素的相关性研究

郭广秀，张功亮，肖军兰，黄金长，王建

(赣州市人民医院 病理科，江西 赣州 341000)

柯萨奇-腺病毒受体 (Coxsackie and adenovirious receptor，CAR)是柯萨奇 B病毒(CBV)和腺病毒(ADV)与靶细胞结合的共同受体。CAR因其作为腺病毒受体介导携带治疗基因的腺病毒载体进入宿主细胞发挥治疗作用而受到广泛关注[1]。CAR作为细胞间粘附分子，参与了多种肿瘤发生发展的病理过程[2]。本文应用免疫组化方法检测CAR在肺癌和癌旁组织中的表达情况，并分析其与临床病理因素之间的关系。

1 材料与方法

1.1 一般材料 收集2009年1月至2012年12月我院病理诊断明确的肺癌手术切除标本70例、支气管镜活检标本5例，其中鳞癌43例，腺癌27例，小细胞癌5例。同时采用癌旁(距离癌肿5cm以外)组织作为对照组。所有组织均经10%中性缓冲福尔马林固定10h，石蜡包埋组织。

1.2 试剂 鼠抗人CAR单克隆抗体购买自美国Upstate公司，EnVision试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法及步骤 免疫组化EnVision法：观察存档肺癌及癌旁组织玻片，挑选对应最佳蜡块，4um切片，60℃考片1h，二甲苯脱蜡后置酒精，水化后置入PBS液，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，用0.01M、pH6.0枸橼酸盐缓冲液抗原修复，100℃15min，自然冷却，CAR(1:100)一抗孵育，4℃过夜，0.01M、pH7.2～7.4PBS 冲洗 10min， 再用 En-Vision 二抗孵育，37℃ 60min，0.01M、pH7.2～7.4PBS冲洗10min，DAB显色(显微镜下观察，及时终止显色)，苏木素衬染，二甲苯透明，中性树胶封片。用PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定 所有切片均经由两位有经验的病理医师进行阅片、计数及判断。随机选择5个高倍镜视野(×400倍)，呈色强度得分：未染色0分，黄色1分，棕黄色2分，棕黑色3分。呈色百分率得分：无阳性细胞 0分，＜25%1分，25%～50%2分，＞50%3分。两项得分相加即为CAR表达的最后得分：0 分为(-)，1～2 分为弱阳性(+)，3～4 分为中度阳性(++)，5～6 分为(+++)。表达程度分为：(-)和(+)为阴性表达，(++)和(+++)为阳性表达。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计学软件，应用χ2检验对不同组织间CAR表达的差异进行比较，并分析其与临床病理因素的关系，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CAR在肺癌及癌旁组织中的表达 CAR阳性定位于细胞膜上，胞浆内少量表达，呈棕黄色颗粒状。肺癌组织着色较深(++)～(+++)，多呈弥漫阳性(图1)，而癌旁组织着色较浅，且呈灶性阳性(图2)。

图1 CAR在鳞癌组织中表达，呈弥漫阳性 SP法(×200)

图2 CAR在癌旁组织中的表达，呈灶性阳性SP法(×200)

CAR在肺癌组织中的阳性表达率为57.3%(44/75)，癌旁组织中的阳性率 9.3%(7/75)，两者间差异有统计学意义(P＜0.01)(见表1)。

表1 CAR在肺癌及癌旁组织中的表达[n(%)]

2.2 肺部组织CAR表达与临床病理因素的关系在不同的临床病理因素中，CAR的表达在淋巴结转移中差异有统计学意义(P＜0.05)，但在患者不同性别、年龄、吸烟与否、肿瘤大小、TNM分期等因素中差异无统计学意义(P＞0.05)。CAR在腺癌及小细胞癌中的表达阳性率分别为74.1%(20/27)、80.0%(4/5)，而鳞癌仅为46.5%(20/43)，三者间差异有统计学意义(P＜0.05)(见表 2)。

2.3 CAR的表达在肺鳞癌及腺癌不同组织学分级中的差异均无统计学意义 (P＞0．05)(见表3)。

3 讨论

柯萨奇-腺病毒受体(CAR)是分子量为45KD的Ⅰ型跨膜单倍，能够介导腺病毒与靶细胞的结合，在以腺病毒为载体的基因治疗领域起着重要作用[3]。CAR表达具有组织特异性和物种特异性[4]，在人类胰腺、脑、心脏、小肠、睾丸以及前列腺中含量最高，在肝脏和肺中有少量表达，而在肾脏、胎盘、末梢血白细胞，胸腺和脾脏中则无。CAR作为细胞间粘附分子，可能参与了多种肿瘤发生发展的病理过程，在多种肿瘤细胞中CAR表达均有不用程度的降低或缺失，并且随着肿瘤的恶性度增高，CAR的表达丢失更明显。Jonas等[5]研究发现，CAR在神经胶质瘤组织中表达下调，Ⅱ期和Ⅲ期肿瘤CAR表达高于Ⅳ期，其间差异明显。在前列腺组织中，CAR无论是在表达强度还是表达率上都较正常前列腺组织发生明显下调，且随着肿瘤恶性程度的升高，其下调也愈明显。在膀胱尿路上皮癌也出现类似现象，而且CAR表达水平与肿瘤的病理分级、肌层侵犯、区域淋巴结转移以及P53表达密切相关。然而，近来的研究发现[6]，在大多数骨肉瘤细胞系中CAR高度表达。Ito等发现鼠骨折模型中非成熟的成骨细胞亦有CAR的高水平表达。另外，所有的Ewing氏肉瘤细胞系都有CAR的高表达。所以我们可以看出，CAR在不同类型肿瘤中发挥着不同的生物学功能，在有些肿瘤中扮演了抑制肿瘤生长、转移及侵袭的角色，而在另一些肿瘤中发挥着相反的作用。Qin等[7,8]发现在体外试验表面CAR表达有利于非小细胞肺癌的形成，同时预示在体内CAR的表达在肿瘤的增殖中是必须的，并且激发肺癌细胞某种亚型的有效形成中也是必须的。以腺病毒为载体的基因治疗由于具有技术成熟、操作简便和安全性好等优点，进展尤为迅速。在本研究中，肺癌组织中CAR的表达水平显著高于癌旁组织，提示CAR在肺癌的发生发展中起到了重要作用。但CAR的表达在肺鳞癌、腺癌不同组织学分级中的差异无统计学意义，说明CAR的表达可能与肺鳞癌及腺癌恶性程度无明显相关性。

表2 肺癌组织CAR表达与临床病理因素的关系[n(%)]

表3 鳞癌及腺癌不同组织学分级中CAR表达比较[n(%)]

CAR为细胞表面的病毒受体，在细胞粘附、上皮细胞极性形成以及细胞的接触抑制机制等方面起着重要作用，并可以抑制肿瘤的恶性进程及侵袭转移[9]。本研究结果表明，在不同的临床病理因素中，CAR的表达在淋巴结转移中有统计学差异，发生淋巴结转移的病例CAR表达的阳性率较低，说明CAR在一定程度上抑制了肺癌细胞向淋巴结转移。但在患者不同性别、年龄、吸烟与否、肿瘤大小等因素中差异无统计学意义(P＞0.05)。值得注意的是，TNM分期中Ⅰ~Ⅱ期CAR阳性表达率较高(66.7%，28/42)，Ⅲ~Ⅳ期阳性率较低(48.5%，16/33)，说明CAR的表达与肺癌的TNM分期可能有一定的关系，即TNM分期越晚，CAR表达越不显著，但尚未达到有统计学差异的程度，分析其原因可能为：肺癌TNM分期不单与淋巴结转移有关，还与肿瘤大小及是否有远处转移有关，这几个因素都会对统计学结果产生影响，也有可能与本研究样本量较小有关，更为精确的统计学分析有待于今后扩大样本进一步研究。

本研究还发现，CAR在不同组织类型的肺癌细胞中表达存在统计学差异，腺癌及小细胞癌的CAR表达明显强于鳞癌的表达，说明CAR的表达与肿瘤细胞起源有关，并与肺腺癌及小细胞癌形成发展关系更为密切，与顾安康[10]、鲍永仪等[11]的报道一致，这将为我们选择靶向药物或基因治疗不同组织学类型的肺癌提供一定的理论依据。

本研究不足之处：本研究属于小样本分析，更为精确的结果有待于更大样本的研究。另外关于CAR对肺癌细胞具体的作用机制还不清楚，CAR与肺癌的增殖指数及预后等的关系还有待于进一步研究。

[1]董元焕.柯萨奇病毒腺病毒受体与肿瘤的研究[J].牡丹江医学院学报,2012,33(2):55-57.

[2]Yamashita M,Ino A,Kawabata K,et al.Expression of CAR reduces the lungmetastatic potential ofmurine tumor cells[J].Int Cancer,2007,121(8):1690-1696.

[3]张林琳,贺大林.柯萨奇-腺病毒受体在肾癌组织中的表达及意义[J].中国肿瘤临床,2005,32(20):1141-1143.

[4]Ito M,Kodama M,Masuko M et al.Expression of Coxsackievirus and adenovirus receptor in hearts of rats with experimental antoimmunemyocarditis[J].Circ Res,2000,86(3):275-280.

[5]Fuxe J,Liu L,Malin S,et al.Expresson of the Coxsackievirus and adenovirus receptor in human astrocytic tumor and xenografts[J].Int JCancer,2003,103(6):723-729.

[6]Schmidtke M,Selinka HC,Helm A,et al.Attachment of Coxsackievirus B3 Variants cell lines:mapping of phenotypic differences to capsid protein VP1[J].Virology,2000,275(1):77-78.

[7]Qin M,Chen S,Yu T,et al.Coxsackievirus adenovirus receptor expression predicts the efficiency of adenoviral gene transfer into non-small cell lung cancer xenografts.Clin cancer Res,2003,9(13):4992-4999.

[8]Qin M，Escuadro B,Dohadwala M,et al.A novel role for the Coxsackie adenovirus receptor in mediating tomor formation by lung cancer cells.Cancer Res,2004,64(18):6377-6380.

[9]Bruning A,Runnebaum IB.The Coxsackievirus adenovirus receptor inhibits cancer cellmigration[J].Exp Cell Res,2004,298:624-631.

[10]顾安康,孙蕾娜,陈照立,等.柯萨奇病毒腺病毒受体在非小细胞肺癌中的表达及其意义[J].中华肿瘤杂志,2009,31(4):278-281.

[11]鲍永仪,关乃富,程羽青.小细胞肺癌组织中柯萨奇—腺病毒受体阳性表达的意义[J].临床肿瘤学杂志,2009,14(2):176-177.