婴幼儿感染猪霍乱沙门菌耐药基因特点及同源性分析

黄凯，余晓君，王晔

(江西省儿童医院检验科，江西 南昌330006)

沙门菌是一种重要的肠道病原菌，主要通过污染的食物、饮用水经口感染进入消化道致病，常引起小范围内的流行。其中猪霍乱沙门菌是引起婴幼儿肠道感染最常见的致病血清型，为了解本地区猪霍乱沙门菌婴幼儿血流感染的流行及耐药的分子特点，本文收集我院2008年至2011年间分离自不同病区患儿血液中的猪霍乱沙门菌16株，同时对其进行耐药基因检测及同源性分析，结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及耐药特点 16株猪霍乱沙门菌均分离自2008年7月至2011年8月我院不同病区各个患儿血液标本，所有菌株均经过标准生化试验和血清学检测。所有被测菌株均对亚胺培南、美罗培南及三代头孢菌素敏感。耐药率最高的复方新诺明(87%，14/16)，其次是氨苄西林(81%，13/16)，氯霉素(75%，12/16)。有5株对环丙沙星中介，其中一株同时对左氧氟沙星中介。16株猪霍乱沙门菌对抗菌药物的耐药谱见文献[1]。

1.2 一般临床资料 16例患儿中男12例、女4例；<1周岁者10例，6例为1~3岁幼儿，分别来自江西不同地区。入院前均有1~10天的高热史，热型不规则，热峰38~40℃，均为急诊收治入院，分别有咳嗽、寒战、腹泻、黄疸及呼吸困难等体征。所有患儿经临床抗菌药物治疗后均已痊愈出院。

1.3 耐药基因的检测 通过煮沸法提取被测菌株的总DNA，即挑取单个克隆菌落于离心管中，再加入150μl的双蒸水煮沸10min，然后4℃以10600×g离心15 min，取上清液-20℃储存作为PCR模板备用。采用PCR法及DNA测序法对16株猪霍乱沙门菌进行β-内酰胺酶类耐药基因检测，包括blaTEM、blaSHV、blaCTX-M，引物序列参照文献[2]。

1.4 PFGE分析 挑取血平皿中培养过夜的单克隆菌株用低熔点胶灌模，蛋白酶K 50℃消化2 h，40 U的Xba I酶切2h，1.0%的脉冲场凝胶电泳仪专用胶，电泳仪为美国Bio-Rad公司生产的CHEFMapperXA，0．5×TBE 缓冲液，温度 14℃，电压为 6V／cm，角度 120°，脉冲时间 5~20s，电泳时间为19h，分子量标记物为LadderDNA。电泳后EB染色，紫外灯观察结果。PFGE结果分型按美国疾病控制和预防中心Tenover等[3]推荐的方法判读，结果少于3个条带不同的被认为同一型。

2 结果

2.1 耐药基因 对氨苄西林耐药的13株(81%，13/16)猪霍乱沙门菌经PCR检测为blaTEM阳性，经测序确定全部为blaTEM-1型，所有菌株的blaCTX-M和blaSHV基因均为阴性。耐药基因检出率见表1。

表1 16株猪霍乱沙门菌耐药基因检测结果[株(%)]

2.2 PFGE结果 所有菌株都可得到清晰的PFGE图谱，PFGE分型图谱见图1，经过聚类分析，16株猪霍乱沙门菌可分为5个PFGE型，分别命名为A~E型。其中A型包含12株菌，B、C、D、E型均为1株菌。13株blaTEM-1基因阳性的猪霍乱沙门菌株分别为 A 型(11株)，B 型(1株)，D 型(1株)；详细结果见表2。

图1 16株猪霍乱沙门菌PFGE分型结果

3 讨论

沙门菌是全球范围内最常见的食源性肠道致病菌，已知的沙门菌血清型有2600余种，其中猪霍乱沙门菌是临床最常见的血清型之一。本次研究表明，细菌对氨苄西林等β-内酰胺酶类抗菌药物严重耐药(81%，13/16)，既往对细菌耐药机制研究发现，产β-内酰胺酶是革兰阴性菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药最重要的原因，TEM是革兰阴性菌中最常见的β-内酰胺酶[4]，是由细菌质粒介导的能被β-内酰胺酶抑制剂(如克拉维酸)所抑制的一类酶，可水解青霉素类抗菌药物。本研究资料显示，13株对氨苄西林耐药菌株对TEM基因检测结果阳性，特异性TEM引物进一步扩增及测序结果显示，全部为TEM-1型广谱β-内酰胺酶。说明细菌对β-内酰胺类抗菌药物的耐药性主要由TEM基因编码，产TEM-1型β-内酰胺酶是本地区猪霍乱沙门菌对氨苄西林耐药的主要机制。

注：－表示菌株未检测出耐药基因或未对抗菌药物产生耐药，(I)为中介；AMP为氨苄西林，SXT为复方新诺明，C为氯霉素，CIP为环丙沙星，LEV为左旋氧氟沙星。

PFGE分型方法是直接针对整个细菌染色体DNA进行分析，采用稀有位点限制性内切酶将染色体切成5~30条大小约为10~800kb的片段，再通过2个或多个交变电场，使得DNA分子的电泳方向随电场的变化而变化，在凝胶中呈蛇形向前移动，从而使大分子DNA得到分离，PFGE分辨力高，重复性好，是目前最理想的分型方法，常作为评价其它分型方法的参考标准[5,6]。本研究采用此方法对猪霍乱沙门菌进行分型，所有菌株都可得到10~20条左右条带，16株猪霍乱沙门菌共分为5个PFGE型，分型结果较好。对比PFGE分型结果和耐药基因测定结果可以看出，A 型是最主要的类型(75%，12/16)，13株blaTEM-1基因阳性菌株A型中有11株，说明本地区猪霍乱沙门菌肠道外感染主要是由克隆性传播所引起的。分析耐药谱测定结果可以看出，同种PFGE型有着相同或非常相似的耐药谱，PFGE型相同而耐药谱不同的情况则可能是由于耐药基因发生突变，但是突变位点并不在PFGE酶切位点上，导致耐药情况不能从PFGE分型上体现出来[7]。从临床资料分析上看，同一PFGE型中的细菌或来自江西不同地区，或来自不同时间，考虑为院外散发感染，虽为同一克隆传播，但可以排除院内交叉感染可能。

[1]黄凯,段荣,余晓君.16例婴幼儿败血症猪霍乱沙门菌感染的耐药性分析[J].实验与检验医学,2012,30(5):466-467.

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