人型支原体ParE基因突变与耐氟喹诺酮类药物的关系

罗永慧，段颖卿，甘雪华，王旭菲，舒向荣

(江西省妇幼保健院，江西 南昌330008)

人型支原体(Mycoplasma hominis，Mh)是泌尿生殖道感染的常见病原体[1，2]。氟喹诺酮类药物因具有较强的抗支原体活性而广泛应用于支原体感染的临床治疗。但近年来,Mh对该类药物的耐药性日益增加。本实验通过设计针对Mh拓扑异构酶ⅣParE基因的特异性引物,对耐氟喹诺酮类药物Mh株ParE基因所编码的氨基酸序列进行分析，了解本地区临床Mh株ParE基因突变与耐氟喹诺酮类药物的关系，结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 选取从泌尿生殖道分泌物中分离的8株对4种氟喹诺酮类药物呈不同耐药的Mh为研究对象。Mh的培养、鉴定、药物敏感性试验判断方法见操作说明,所用试剂为珠海迪尔生物公司产品。

1.2 仪器与试剂 电泳仪、电泳槽系美国BIORAD公司产品，PCR仪系珠海黑马医学仪器有限公司产品。PCR系列试剂、DNA marker为New England Biolabs公司产品。

1.3 检测方法

1.3 .1引物设计和合成 采用Bebear等[3]设计的一对引物，ParE基因的上游引物为 5′-CTTTCAGGAAAATTAACTCCT-3′，下游引物为 5′-ATCAGTGTCAGCATCTGTCAT-3′,引物由上海生工公司合成。

1.3 .2耐药菌株DNA模板制备 取耐药菌株培养物500μl，12000r/min离心20min,弃上清液，沉淀物中加入标本裂解液，100℃水浴 10min，12000r/min离心5min后取上清液作为DNA模板。

1.3 .3 ParE-PCR扩增 将dNTP、MgCl2、 上下游引物、模板DNA和DNA聚合酶分别加入到反应管中，反应体系50μl，充分混匀后行PCR扩增。扩增条件为92℃预变性10min后进入循环，92℃60s,57℃60s,72℃120s, 共 40个循环后再 72℃450s，终止反应。取扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，保存扩增产物备用。

1.3 .4序列测定及基因序列比对 PCR扩增后的目的片段经回收、纯化后，以PE公司产的ABI310型自动测序仪测DNA序列。所测序列与野生株MHPG21的ParE基因核苷酸序列进行比对。

2 结果

2.1临床分离的Mh菌株对氟喹诺酮类药物的药敏结果 采用肉汤稀释法检测临床分离的Mh对4种氟喹诺酮类药物的药敏结果，并对这些菌株的耐药表型与ParE基因所编码的氨基酸残基变异进行分析，结果见表1。

表11 MM hh菌株对44种氟喹诺酮类药物的药敏结果及ParE基因编码的氨基酸变异

2.2 ParE基因扩增产物经PCR扩增后获得Mh菌株ParE基因片段经琼脂糖凝胶电泳，在约297bp处有特异性扩增条带 ，与引物预期扩增产物相符合,结果见图1。

图1 ParE基因扩增产物

2.3 ParE基因扩增产物测序 将ParE-PCR扩增产物测序，测序结果经PUBMED数据库对比分析，临床所分离的Mh耐药株中，有6株检出对应于野生株 (PG21)ParE基因所编码氨基酸序列426位D(Asp天冬氨酸)转变为N(Asn天冬酰胺)。

3 讨论

氟喹诺酮类药物因具有较强的抗支原体活性而广泛应用于支原体感染的临床治疗，其机理主要是作用于支原体DNA螺旋酶和拓扑异构酶Ⅳ，通过阻止DNA复制、修复、染色体的分离、转录及其他功能，达到杀菌的目的。DNA螺旋酶和拓扑异构酶Ⅳ分别由GyrA、GyrB和ParC、ParE两组基因编码。这两组基因若发生变异，相应氨基酸改变，导致靶酶改变，将阻止氟喹诺酮类药物进入作用区，从而产生耐药性。

对Mh耐氟喹诺酮类药物的分子机制研究，国内外报道主要是体外筛选诱导耐药株，并对相关基因所编码的氨基酸序列进行分析，以发现耐药相关性氨基酸变异。国内对GyrA基因变异与Mh耐氟喹诺酮类药物的相关性报道较多，而对Mh临床分离株ParE基因变异与其耐氟喹诺酮的相关性研究甚少[4，6]。Bebear等[3]率先对 Mh 参考株 PG21的拓扑异构酶Ⅳ亚单位ParC和ParE基因进行克隆并测序。随后作了系统的研究，对Mh参考株PG21进行体外药物诱导，然后检测筛选株中GyrA、GyrB和ParC、ParE基因的变异情况，研究说明了DNA螺旋酶是司帕沙星作用的原始靶位,而拓扑异构酶IV是氧氟沙星、环丙沙星和培氟沙星作用的原始靶位。对于Mh临床分离株的检测,研究显示除GyrA基因变异外，同样存在ParC和ParE基因的变异[7]。张冉等[8]将MHPG21药物诱导后进行ParE基因突变检测，发现误义突变主要存在70位的G→A，导致其编码的426位天冬氨酸被天冬酰胺取代；提示ParE基因中的点突变可能是耐药机制的一部分。

本研究中对氧氟沙星、左氧氟沙星和环丙沙星多种药物耐药或中介的6株Mh临床分离株中检出ParE基因所编码的氨基酸426位D(Asp天冬氨酸)转变为N(Asn天冬酰胺),这一突变与以往报道的对Mh诱导株和临床分离株结果相一致[8,9]；还有2株未检测出氨基酸变异，其耐药性可能与别的耐药机制有关；结果表明本地区的Mh临床流行耐药株的耐药性可能与ParE基因所编码的氨基酸残基发生D426→N变异有关。氨基酸变异导致的耐药可能为取代的氨基酸与被取代的氨基酸所带电荷不同,极性上有差别,或结构相差较大,或羟基残基丢失等,使得相应蛋白酶的空间结构改变,影响了酶与氟喹诺酮类药物的结合。

总之，正确认识人型支原体耐氟喹诺酮类药物的发生机制,对临床合理选用抗生素,减少耐药性的发生,有效控制支原体感染具有重要意义。

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