聚乳酸/聚乙醇酸新型纳米支架载药体系研制

崔国艳, 颜 娜, 韩 冰

(1. 长治医学院 微生物学教研室， 山西 长治 046000; 2. 北京大学口腔医院 特诊科， 北京 100081; 3. 北京大学 口腔医学院， 北京 100081)

静电纺丝技术是目前制备超细纤维最重要的方法之一，在传感器、防护服和电子元件等领域，尤其在生物医学领域用来制作药物传输与缓控释放的载体及创伤敷料等有着广泛的应用[1-2]。导致组织再生手术失败的最主要原因是术后细菌感染，尤其是在牙周手术中,由于骨骼替代物、手术感染和术后继发感染往往导致牙周炎的发生，这些炎症并发症严重影响了骨组织再生的治疗[3-5]。如今，载抗炎药物的局部缓释系统由于其长期治疗效果和副作用少等优点[6-7]，正成为生物医学治疗的热点。目前应用的各种引导骨再生(guided bone regeneration, GBR)生物膜大都只起机械性的阻挡作用，疗效欠佳，而且在操作及后期使用中经常出现暴露、创口感染等问题，严重影响成功率，因此开发具有抗菌活性的GBR膜尤为重要[8-9]。

聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA)纳米纤维膜具有良好的生物降解性能、力学性能和生物相容性，在生物体内可逐步降解为水和二氧化碳，对人体无害、无积累[10]，然而其降解后形成的局部酸性也会导致周围器官和组织产生炎症反应，这也是人工合成的可降解聚酯类聚合物作为生物材料使用时所共有的缺陷。盐酸四环素是一种广谱抗生素, 没有免疫反应，渗透能力强，具有抗胶原酶活性、抑制骨吸收、消炎和预防组织破坏等作用，常用于预防手术后感染[11-12]。本文将其作为抗菌添加剂，以期制备一种安全、稳定、高效的聚乳酸聚乙醇酸抗菌纳米纤维，为其在再生医学和组织工程材料领域的应用奠定基础。

1 实验部分

1.1 主要材料和仪器

聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA，质均相对分子质量Mw=50 000，美国Sigma公司),盐酸四环素(Tet, 美国Sigma公司),四氢呋喃(THF)，N-N二甲基甲酰胺(DMF)。改良Eagle′s培养基(MEM)、胰蛋白酶和胎牛血清(美国Gibco公司)；人成骨样细胞(MG-63)(北京协和医学院)，CO2恒温培养箱(日本SANYO公司)，紫外光分光光度计(Perkin-Elmer公司)，水平离心机(德国Heraeus公司)，静电纺丝机(北京化工大学)，日立S- 4700 FEG扫描电子显微镜，荧光显微镜(日本Nikon E800公司)。

1.2 实验方法

1.2.1载药纳米纤维膜的制备

将PLGA溶于四氢呋喃和N-N二甲基甲酰胺(体积比为1∶1)的混合溶液中,磁力搅拌,以形成均一的聚合物溶液;将质量分数为3%、5%、10%的Tet溶解在少量的甲醇中，然后滴入PLGA溶液中，超声波充分搅拌得到一种均质的前驱体溶液。

将前驱体溶液装入一个20 mL(内径为0.7 mm)配备一个无污染钢针头的玻璃注射器中。静电纺工艺参数为：电压15～20 kV，接收距离15～20 cm，流速0.3～0.5 mL/h，以滚筒(d=9 cm，2 500～3 000 r/min)为接收装置进行静电纺丝，制备出加载盐酸四环素的PLGA纳米纤维膜，常温下真空干燥1周以完全去除残液，避光保存备用。

1.2.2PLGA/Tet纳米纤维膜形貌的表征

制备的纳米纤维膜真空干燥后，喷金，扫描电镜观察其微观形貌。用ImageJ[13]软件测量纳米纤维的直径，随机选取100根纤维计算纤维的平均直径。在发射波长为360～400 nm处，用荧光显微镜观察盐酸四环素在纳米纤维表面的分布状况。

1.2.3体外释放率

称取不同理论载药量的纳米纤维膜各10 mg，溶解在2 mL THF和DMF(体积比为1∶1)的混合溶液中，然后添加10 mL PBS缓冲溶液 (pH=7.4)，超声振荡，至药物完全溶解。离心(5 000 r/min)20 min，将水相吸出。采用分光光度计在360 nm波长处测定其吸光度。对应标准曲线方程计算药物浓度。标准曲线可通过检测标准浓度的盐酸四环素溶液的吸光度来获得。

称取不同载药量的纳米纤维膜各10 mg，浸入含5 mL PBS的溶液(pH=7.4)中，置于转速为120 r/min，温度为37 ℃的恒温水浴振荡器中。在设定的时间间隔取出5 mL的释放液，然后补加同等体积的新鲜PBS溶液。将取出的释放液采用分光光度法在360 nm波长处测其吸光度，对应标准曲线方程，计算载药纤维的药物浓度及释药量，然后计算累积释药百分率并作累积释药曲线。

1.2.4体外抑菌性能检测

将冻干保存的金黄色葡萄球菌 (ATCC 33592)在营养肉汤培养基中培养，在625 nm处调整菌液浓度使其吸光度值介于0.1和0.2之间，然后将其分装到5 mL离心管中，称取3种不同载药量的纳米纤维膜各0.1 mg，分别加入离心管中，37 ℃孵育，并不断振荡，24 h后所得结果用SPSS 10.0进行数据分析。

用改良的Kirby-Bauer纸片扩散法[14]分析其抑菌性能。将3种不同载药量的纳米纤维膜及阴性对照裁成1 cm×1 cm大小，置于琼脂平板上，于37 ℃下培养4 h,使膜中的药物扩散到琼脂中。将平皿在37 ℃下干燥2 h，取出膜后向琼脂平板上加入100 μL金黄色葡萄球菌的菌液, 于37 ℃培养12 h和48 h后，观察菌落的生长情况。

1.2.5体外生物相容性检测

将不同载药量纳米纤维膜切成直径约为10 mm的圆片, 浸入细胞培养液24 h，然后覆盖于24孔板底部。MG-63细胞用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化，以104/孔密度接种于膜上，标准环境下孵育(37 ℃，5%CO2)，每2～3 d换液。于第3天和7天取出, 用PBS溶液(pH=7.4)洗去残余培养液,2.5%戊二醛固定，4 ℃下静置适当时间。采用梯度乙醇脱水(20%、50%、70%、90%),每个浓度梯度脱水10 min,然后用100%乙醇脱水2次，每次10 min，临界点干燥,喷金，采用扫描电镜观察试样形貌。

2 结果分析

2.1 纳米纤维形貌的表征

图1示出同一纺丝工艺下，添加不同质量分数Tet的纳米纤维膜扫描电镜照片。

图1 不同质量分数Tet纳米纤维的SEM照片(×5 000)Fig.1 SEM images of PLGA/ Tet nano-fibrous at different mass fraction(×5 000)

由图1可见，添加不同比例的Tet后仍能制备出均匀、连续、表面光滑的聚乳酸/聚乙醇酸纳米纤维，各纤维膜中纤维交错重叠，光滑均一，没有明显的珠状膨大结构或纤维黏连现象，呈现出三维网络结构，且纤维表面观察不到药物结晶的存在，表明该药物已渗入纳米纤维中。不同载药量的纤维直径无显著差异，平均直径在360～470 nm之间。

2.2 荧光显微镜形貌观察

尽管得到了光滑均一的PLGA/Tet纳米纤维膜,还不能确认Tet是否均匀分布在纳米纤维上，需荧光显微镜进行观察，如图2所示。由图可直观地看出，质量分数为10%盐酸四环素很好地负载在PLGA纳米纤维内部，纤维表面光滑均一，表明盐酸四环素成功包裹于纳米纤维内部。

图2 10%盐酸四环素在PLGA/Tet纳米 纤维膜上的荧光显微图Fig.2 Fluorescence micrograph of 10% Tet loaded PLGA fibrous membrane

2.3 PLGA /Tet纳米纤维的体外释药性能

不同载药量PLGA/Tet纳米纤维膜的体外释药曲线见图3。

图3 不同载药量PLGA/ Tet纳米纤维膜的 体外释药曲线Fig.3 In vitro release profiles of Tet from PLGA/Tet electrospun nanofibers of different drug loadings

由图可见，不同载药量的纳米纤维膜初期释药速率很快，随着时间的延长，药物的释放速度趋于平缓。其中载药量为10%的纳米纤维突释现象最明显，在24 h内的释放量可达80%以上。且3种载药量的纳米纤维药物释放持续时间都在27 d以上。突释现象是由于纤维表层的药物扩散阻力小，易扩散到溶液中，故导致瞬时释放；当大部分药物释放后，表面及靠近表面的药物已释放完毕，其余药物只能从纤维内部向表面扩散再释放，故导致后期释药速率减缓[15-16]。随着药物含量的增加，突释现象越明显。这可能是由于随着药物含量的增大，扩散的浓度梯度增大，更有利于药物扩散到媒介中。对于抗菌药物而言,一定量的突释是有利的,因为初期高浓度的药物可杀死入侵的细菌，而后期持续释放的抗生素也是必要的,可防止其进一步的入侵以预防术后感染[17]。

2.4 体外抗菌活性

不同载药量的PLGA纳米纤维膜体外抗金黄色葡萄球菌性能如图4所示。

图4 37 ℃共孵育12 h和48 h的抑菌活性的分析结果Fig.4 Bacteria inhibition zone at 37 ℃ for 12 h and 48 h respectively at sites of membranes. (a) Different drug loadings of nanofibers; (b) Bacteria inhibition zone of 12 h; (c) Bacteria inhibition zone of 48 h

由图可见，纳米纤维与金黄色葡萄球菌在37 ℃共同孵育12 h和48 h后，平皿中放置载药纳米纤维膜的位置出现了抑菌环，说明药物扩散到培养基中，且有效抑制了金黄色葡萄球菌生长。载药量为10%的纳米纤维膜的抑菌环直径最大，这意味着加载Tet的量越多，纳米纤维膜释放的Tet越多，抗菌活性也越强；同时,也证实了加载Tet的纳米纤维膜释放的Tet保留了它的生物学性能。相比之下,载药量为0的纳米纤维膜没有抑菌环，导致细菌的增长。另一方面,培养48 h的抑菌环直径明显小于培养12 h的,可能是随着时间的延长，突释减缓，Tet的抑菌能力下降。Kim等[18]报道加载头孢西丁钠的PLGA纳米纤维膜也出现同一现象，他们认为随着时间延长，药物结构分解,导致抑菌环减小。尽管抑菌能力下降,但药物的抗菌活性仍有效且持续地释放，因此，只要加载Tet的PLGA纳米纤维膜持续释放Tet，金黄色葡萄球菌的生长就会受到抑制,在预防组织再生术后粘连和感染中发挥一定作用。

2.5 体外生物相容性分析

图5示出不同质量分数的纳米纤维膜和MG-63细胞体外共培养的电镜图片。从图中可看出，MG-63细胞分别培养3 d和7 d后，细胞呈片状分布在膜上，多个细胞相互交联，说明细胞在支架上黏附和铺展良好。细胞分别培养3 d和7 d时，随着Tet加载量越多，细胞增殖越好。加载10%Tet的纤维膜与加载3%和5%的纤维膜相比，其MG-63细胞的形态和密度无显著差异，这说明PLGA/Tet支架有利于细胞的黏附和增殖。作为一个药物缓释体系，PLGA /Tet膜应能够控制药物的释放和吸收，使药物缓释，药效持续。MG-63细胞培养结果表明, 加载不同比例Tet的PLGA/Tet膜都有很好的生物相容性。这与Park等[19]证实的加载Tet的PLLA支架适于成骨细胞的黏附和生长结果一致，因此，可考虑PLGA/Tet膜作为药物缓释体系植入体内以促进组织愈合。

图5 MG-63在不同载药量的纳米 纤维膜上的黏附和增殖Fig.5 Attachment and proliferation of MG-63 on different drug loadings nanomembrane

3 结 论

该纤维的纺丝工艺条件为：Tet的添加比例3%、5%、10%，纺丝电压15～20 kV，接收距离15～20 cm，流速0.3～0.5 mL/h；能够成功制备出均匀、光滑的PLGA/Tet纳米纤维；所制纤维都存在突释现象，且加载10% Tet的纳米纤维的突释现象最明显，其释药时间可持续27 d以上。体外抗菌活性结果表明：加载Tet的量越多，抗菌活性越强，且培养12 h的抑菌圈直径大于培养48 h的；体外细胞相容性测试结果表明PLGA/Tet支架具有良好的生物相容性，可作为物理屏障分隔受伤的组织和邻近组织。

FZXB

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