菜籽凝血酶抑制肽的酶法制备研究

王子伟，章绍兵，陆启玉，胡存书，李宇波

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

0 引言

凝血是机体重要的生理防御过程，可诱发血栓，其导致的病理性血栓可引发如肺梗塞、脑血栓、视网膜动静脉阻塞、心肌梗塞和四肢及周围血管栓塞等疾病，严重危害着人类的生命健康.凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，在凝血过程中起关键作用，因此，凝血酶可以作为抗凝治疗的理想靶点，通过抑制凝血酶的活性可以有效地阻碍凝血过程的发生[1].目前，一些肽类化合物已被发现具有显著的抗凝血活性，按抗凝血活性肽的来源不同可将其分为非食物源肽和食物源肽两大类，其中非食物源抗凝肽已有较长的研究历史，而食物源抗凝肽的研究近年来才引起广泛的关注.

油菜是世界上仅次于大豆的第二油料作物，我国油菜产量居世界首位.菜籽粕是菜籽油加工过程中的主要副产物，其蛋白含量30%～45%.菜籽蛋白氨基酸组成合理，与WHO/FAO 推荐的氨基酸组成模式相近，是一种优良的植物蛋白.菜籽蛋白肽一般是菜籽蛋白经过蛋白酶水解作用后，再经特殊处理得到的产物.与菜籽分离蛋白相比，菜籽蛋白肽的溶解性、起泡性及起泡稳定性均优于菜籽分离蛋白[2]，同时菜籽蛋白肽还具有多种生物活性[3-8]，因此值得进一步开发利用.

作者从冷榨制油获得的菜籽饼中提取出菜籽蛋白，研究多种蛋白酶对菜籽蛋白的水解特性，以及水解产物抑制凝血酶的活性；并对采用最优酶种制备菜籽凝血酶抑制肽的工艺条件进行了优化.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷榨菜籽饼（水分13.2%，蛋白质33.3%，粗脂肪13.7%）：湖北楚福油脂有限公司赠送.2709 碱性蛋白酶：北京东华强盛生物科技有限公司，实测酶活135 000 U/g，厂家推荐最适条件：温度60 ℃、pH 8.5.Alcalase 2.4L：诺维信（中国）生物科技有限公司，实测酶活154 000 U/mL，厂家推荐最适条件：温度50 ℃、pH 8.5.Protex 6L：杰能科（无锡）生物工程有限公司，实测酶活123 000 U/mL，厂家推荐最适条件：60 ℃、pH 8.5.Protex 7L：杰能科（无锡）生物工程有限公司，实测酶活67 000 U/mL，厂家推荐最适条件：50 ℃、pH 7.5.Neutease 1.5MG：诺维信（中国）生物科技有限公司，实测酶活89 000 U/g，厂家推荐最适条件：50 ℃、pH 7.5.凝血酶：索莱宝（北京）生物科技有限公司.纤维蛋白原：Sigma公司.其他试剂均为分析纯.

1.2 主要仪器与设备

FW-200 高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；TD5-4B 离心机：北京时代北利离心机有限公司；DW-2 无级恒速搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；LGJ-10C 型四环冻干机：北京四环科学仪器厂；RT-6000 酶标仪：Rayto 公司.

1.3 试验方法

1.3.1 菜籽蛋白的制备

菜籽饼经粉碎机粉碎，使用石油醚索氏抽提15 h 脱油，室温晾干去除溶剂得到菜籽粕；将菜籽粕以1∶15（g/mL）加入蒸馏水中，用1 mol/L 的NaOH 溶液调节pH 为12，40 ℃下搅拌1.5 h；然后4 000 r/min 离心10 min，收集上层清液；上清液用1 mol/L 的盐酸调节pH 至4.5 使蛋白质等电点沉淀，静置1 h 后4 000 r/min 离心10 min，水洗沉淀2～3 次，得到菜籽蛋白，冷冻干燥（蛋白质含量为85.1%），收集备用.

1.3.2 蛋白酶活力的测定

参照GB/T 23527—2009 蛋白酶制剂.

1.3.4 蛋白酶酶解菜籽蛋白

准确称取3.0 g 菜籽蛋白，溶解于100 mL 蒸馏水中，调节酶解温度和pH（碱性蛋白酶2709，60 ℃，pH 8.5；Alcalase 2.4L，60 ℃，pH 8.5；Protex 6L，60℃，pH 8.5；Protex 7L，50 ℃，pH 7.5；Neturase 1.5 MG，50 ℃，pH 7.5），加入5 000 U/g 蛋白酶，开始计时；同时在水解过程中加入0.1 mol/L 的NaOH维持pH 值恒定；每10 min 记录一次耗碱量，酶解1.5 h.反应结束后将水解物于100 ℃加热15 min钝化蛋白酶，待其自然冷却后以4 500 r/min 离心15 min，收集上清液，置冰箱中备用.

1.3.5 菜籽蛋白质水解度测定

采用pH-stat 法，通过下式计算水解度[9].

式中：V 为NaOH 溶液消耗体积，mL；C 为NaOH 溶液浓度，mol/L；m 为菜籽蛋白样品中蛋白质质量，g；h 为每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数，h=7.8 mmol/g[3]；T 为试验温度，K.

1.3.6 菜籽蛋白水解物凝血酶抑制率测定

采用酶标仪法[10-11]，将酶标仪的温度设定为37 ℃，测定波长设定为405 nm.纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液均以Tris-HCl 缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.2）配制.向酶标板的小孔中加入140 μL 0.1%（W/V）纤维蛋白原溶液和40 μL 样品溶液，混匀后读数（ASB）.再加入10 μL 凝血酶溶液（12 U/mL）开始反应，10 min 后读数（AS）.取40 μL Tris-HCl 缓冲液代替样品溶液，其他操作同样品管，测得吸光值（ACB和AC）.按下式计算样品抑制凝血酶催化纤维蛋白原形成纤维蛋白的能力.

1.3.7 酶解条件对菜籽蛋白水解度和凝血酶抑制率的影响

在1.3.4 基础上，选取优势酶，分别考察酶解温度、pH、加酶量和酶解时间对菜籽蛋白水解度和凝血酶抑制率的影响.

1.4 统计分析

试验结果以两次以上结果的平均值表示，并使用SPSS 16.0 for Windows 软件进行单因素方差分析，p＜0.05 代表差异显著.

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶酶解菜籽蛋白

采用不同蛋白酶在各自最适条件下酶解菜籽蛋白（底物浓度为3.0 g/100 mL），其水解度随时间的变化如图1 所示.

图1 不同蛋白酶酶解菜籽蛋白的水解度随时间的变化

由图1 可知，尽管所用蛋白酶的种类不同，但都在前10 min 显示了最大的水解速率；随着反应时间的延长，水解度变化减缓.虽然反应体系中加入酶活力的量是相同的，但是不同种类蛋白酶对菜籽蛋白水解度的影响有显著差别.碱性蛋白酶2709、Alcalase 2.4L、Protex 6L 的水解度明显高于中性蛋白酶Protex 7L 和Neturase 1.5MG，说明碱性蛋白酶对菜籽蛋白的酶解效率要远高于中性蛋白酶，原因可能与在碱性体系中菜籽蛋白的溶解性更好有关.

不同蛋白酶酶解反应1.5 h 后，酶解液的凝血酶抑制率如图2 所示，其中空白为未加入蛋白酶的菜籽蛋白溶液.由图2 可知，酶解反应提高了菜籽蛋白的凝血酶抑制率，说明酶解液中存在可以抑制凝血酶催化纤维蛋白原反应的产物；但是，不同蛋白酶的酶解液对凝血酶的抑制率不同，其中Alcalase 2.4L 的抑制率最高，达到80%左右.尽管碱性蛋白酶2709 和Alcalase 2.4L 酶解液的水解度十分接近，但前者的凝血酶抑制率却较低.所以，本试验选取Alcalase 2.4L 制备菜籽凝血酶抑制肽.

图2 不同菜籽蛋白酶酶解液的凝血酶抑制率

2.2 Alcalase 2.4L 酶解制备菜籽凝血酶抑制肽的条件优化

2.2.1 酶解温度对菜籽蛋白质水解度和凝血酶抑制率的影响

在底物浓度3.0 g/100 mL，加酶量5 000 U/g，pH 8.5，温度分别为40、45、50、55、60 ℃的条件下酶解菜籽蛋白，酶解过程中加入0.1 mol/L NaOH维持pH 恒定，反应1.5 h；反应结束记录总耗碱量并测定产物的抗凝活性，通过计算得到温度对菜籽蛋白水解度及凝血酶抑制率的影响，见图3.

图3 温度对菜籽蛋白水解度和凝血酶抑制率的影响

由图3 可知，随着温度的升高，水解度不断上升，但当温度升至55 ℃后，随着温度的升高水解度反而下降，可能温度升高使蛋白酶的构象发生了变化，影响到酶与蛋白的结合.在试验范围内凝血酶抑制率总体随温度变化不大，45 ℃酶解时抑制率较低，而60 ℃时结果偏高.同时在60 ℃酶解液的水解度并不是最高，为避免蛋白水解度较高可能会带来味苦的问题，选取酶解温度60 ℃较为合适.

2.2.2 酶解pH 对菜籽蛋白质水解度及凝血酶抑制率的影响

在底物浓度3.0 g/100 mL，加酶量为5 000 U/g，反应温度60 ℃，pH 分别为8、8.5、9、9.5、10 的条件下进行酶解，酶解过程中加入0.1 mol/L NaOH维持pH 恒定，反应1.5 h；反应结束记录总耗碱量并测定产物的抗凝活性，通过计算得到pH 对菜籽蛋白水解度及凝血酶抑制率的影响，见图4.

图4 pH 对菜籽蛋白水解度和凝血酶抑制率的影响

如图4 所示，当pH 为9.5 时，菜籽蛋白的水解度最高，过高或过低的pH 均会抑制蛋白酶的活性，使水解度下降.在所有酶解pH 中，pH 值为8.5时酶解液的凝血酶抑制率最高，故选择酶解最佳pH 为8.5.菜籽肽凝血酶抑制率与水解度之间没有明显关系，即高水解度对应的抑制率不一定最高（这在前面的试验结果中也有所体现）.实际上，水解度较低时，蛋白水解不完全，可能会导致部分抗凝血活性较强的多肽不能被水解出来；而过度水解可能会导致部分抗凝血活性较强的多肽被水解为寡肽，造成了抗凝血活性的削弱.因此不能简单地认为菜籽蛋白水解度越大，抗凝血活性越强.

2.2.3 加酶量对菜籽蛋白质水解度及凝血酶抑制率的影响

在底物浓度3.0 g/100 mL，反应温度60 ℃，pH 8.5，在加酶量分别为3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 U/g 的条件下进行酶解，酶解过程中加入0.1 mol/L NaOH 维持pH 恒定，反应1.5 h；反应结束记录总耗碱量并测定产物的抗凝活性，通过计算得到加酶量对菜籽蛋白水解度及凝血酶抑制率的影响，见图5.

图5 加酶量对菜籽蛋白水解度及凝血酶抑制率的影响

从图5 可以看出，在试验范围内，水解度随加酶量的增加而增加，当加酶量超过5 000 U/g 时，水解度增加趋缓；凝血酶抑制率随加酶量的变化较为复杂，加酶量在4 000 U/g 时抑制率最低，而在7 000 U/g 时，抑制率最高，约为90%.从经济成本角度考虑，没有选择更高的加酶量进行试验，最终选择最适加酶量为7 000 U/g.

2.2.4 酶解时间对菜籽蛋白质水解度和凝血酶抑制率的影响

在底物浓度3.0 g/100 mL，加酶量为7 000 U/g，反应温度60 ℃，pH 8.5 的条件下进行酶解，酶解过程中加入0.1 mol/L NaOH 维持pH 恒定，分别反应0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，反应结束记录总耗碱量并测定产物的抗凝活性，通过计算得到酶解时间对菜籽蛋白水解度及凝血酶抑制率的影响，见图6.

图6 酶解时间对菜籽蛋白水解度及凝血酶抑制率的影响

由图6 可知，水解度随着酶解时间的延长逐渐增大，但从1.5 h 起增长趋于平缓.同时，抑制率也随酶解时间的延长逐渐增加，在2.0 h 达到最高，而进一步延长酶解时间（水解度基本无变化）凝血酶抑制率却有明显降低.这说明菜籽蛋白酶解到一定程度后，反应时间进一步延长（超过2.0 h），菜籽蛋白的水解度即使变化很小（即菜籽肽的分子质量变化很小），也会引起产物抑制凝血酶活性发生较大的变化.因此在制备菜籽抗凝血肽时，反应时间需要严格控制.本试验最终选定酶解时间为2.0 h，此时酶解液的凝血酶抑制率可达到98.8%，菜籽酶解液的水解度为18.1%.

通过工艺条件优化后得到的菜籽蛋白酶解液具有显著的凝血酶抑制活性，但因为菜籽粕中含有较多酚类物质，致使制备的酶解液颜色较深，直接作为功能饮料的配料使用存在一定的局限性，可以考虑通过活性炭或大孔树脂等较为成熟的手段将其脱色后再进行应用.

3 结论

通过比较不同蛋白酶对菜籽蛋白水解度以及水解产物凝血酶抑制活性的影响，筛选出最适合制备菜籽凝血酶抑制肽的酶种为Alcalace 2.4L.在此基础上探讨了碱性蛋白酶Alcalace 2.4L 酶解菜籽蛋白的相关条件及酶解产物的抗凝血活性，确定Alcalace 2.4L 酶解菜籽蛋白制备凝血酶抑制肽的工艺条件：底物浓度为3.0 g/100 mL、温度60℃、pH 8.5、加酶量为7 000 U/g、酶解时间2 h，在此条件下菜籽蛋白酶解液的凝血酶抑制率可达到98.8%.

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