大孔树脂法纯化刺玫果总皂苷工艺研究

2014-03-27钟方丽王晓林付丽娟薛健飞

河南工业大学学报（自然科学版） 2014年1期

钟方丽，王晓林，付丽娟，薛健飞

（吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林 132022）

0 前言

刺玫果系蔷薇科蔷薇属植物山刺玫（Rosa davurica Pall.）的成熟果实，广泛分布于我国东北、内蒙、山西等省，其营养价值高，是纯天然绿色食药同源、有广阔开发前景的野生果类[1-2].皂苷是一类具有降血糖、降血脂、抗病毒、抑制肿瘤和免疫调节等多种药理作用的化学成分，除用作药物外，在化妆品和食品工业也有广泛的应用[3-4].皂苷类化合物是刺玫果的活性成分之一，刺玫果水提物及醇提物均可降低大鼠、兔的血压及脑血管阻力、增加冠脉流量、抑制血小板聚集、延长凝血时间、抑制血栓形成.临床测试发现老年人服用刺玫果浸膏粉后，血流速度明显加快、血液黏度明显下降，刺玫果的这些作用与其所含皂苷化合物有关[5].大孔树脂为一种有机高聚吸附剂，具有选择性吸附有机化合物的能力，应用于皂苷类成分的纯化有较好的效果[6-7]，而有关刺玫果总皂苷纯化工艺的研究尚未见报道.因此，笔者选用6 种不同型号的大孔树脂进行了刺玫果总皂苷纯化，并对D-101型大孔树脂纯化刺玫果总皂苷的工艺条件进行了优化，以期为进一步开发和利用刺玫果提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺玫果采自吉林市丰满区，经吉林化工学院药学系薛健飞博士鉴定为蔷薇科蔷薇属植物山刺玫的成熟果实；大孔树脂（LSA-21、LSA-10、AB-8、LX-36、D-101、LSA-33）：西安蓝晓科技有限公司；齐墩果酸（供含量测定用）：中国药品生物制品检定所；无水甲醇、无水乙醇：天津市北方天医化学试剂厂；香草醛：沈阳市试剂三厂；冰乙酸：天津市福晨化学试剂厂；浓硫酸：天津市双船化学试剂厂；水为重蒸馏水.

1.2 仪器与设备

752N 型紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；R-52AA 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D 型循环水真空泵：河南省巩义市英峪仪器一厂；CS101-AB 型电热鼓风干燥箱：中国重庆实验设备厂；JY2002 型电子天平：上海精密科学仪器有限公司.

1.3 方法

1.3.1 总皂苷含量测定

1.3.1.1 标准曲线的制备

精确称取干燥至恒重的齐墩果酸对照品2.1 mg，置于10 mL 容量瓶中，加无水甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.21 mg/mL 的齐墩果酸对照品溶液[8].分别取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分别置于10 mL 的具塞试管中，于70 ℃水浴上挥发除去溶剂；加入5%香草醛-冰醋酸2 mL，70%硫酸溶液5 mL，60 ℃水浴加热20 min，流水冷却10 min，摇匀[9-10]，以相应的试剂为空白，于544 nm 处测定吸光度A.进行线性回归，得回归方程：A=0.026 1C-0.063 6（R=0.999 3），其中C 为齐墩果酸浓度，μg/mL.结果表明吸光度与齐墩果酸浓度在6.0～36.0 μg/mL 范围内呈良好的线性关系.

1.3.1.2 样品含量测定

取样品液、吸附后液及解吸液各适量，置于10 mL 具塞试管中，照“1.3.1.1”的方法，于544 nm 处测定吸光度，以不加供试品的平行样为空白.从标准曲线上读出供试品溶液中齐墩果酸的量，计算即得供试品中总皂苷的含量.以树脂吸附率、解吸率为指标来考察6 种树脂对刺玫果总皂苷纯化的选择性.各指标的计算公式如下[11]：

吸附率=[（C0-C1）/C0]×100%；

解吸率={V2×C2/[V1×（C0-C1）]}×100%；

纯度=（m2/m1）×100%；

式中：C0为起始样品液的总皂苷浓度，mg/mL；C1为吸附48 h 后溶液的总皂苷浓度，mg/mL；C2为解吸液的总皂苷浓度，mg/mL；V1为样品液体积，mL；V2为解吸液体积，mL；m1为解吸液干燥后固体的质量，mg；m2为解吸液中总皂苷的测定量，mg.

1.3.2 刺玫果总皂苷提取液的制备

称取粉碎后刺玫果50 g，分别加入8 倍生药量的80%乙醇，加热回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，放冷后过滤，滤液减压蒸馏回收乙醇，浓缩至相对密度为1.31～1.35（60 ℃），蒸馏水定容至250 mL 容量瓶中，摇匀，得刺玫果提取原液，备用.

1.3.3 树脂的预处理[12]

取大孔吸附树脂LX-36，LSA-33，LSA-10，D-101，AB-8，LSA-21 各50 g 加入柱内，先以95%乙醇连续洗涤数次约2 h，至流出液加水（1∶5）不混浊为止，后用蒸馏水洗至无醇味，然后用5%HCl 浸泡4 h 后以4～6 BV/h 洗涤2 h，再用蒸馏水洗至中性，最后用2%NaOH 溶液浸泡6 h 后以4～6 BV/h洗涤2 h，再用蒸馏水洗至中性，抽滤至干，置于密闭容器中备用.

2 结果与分析

2.1 静态吸附及静态解吸考察

取处理后的湿树脂LX-36、LSA-33、LSA-10、D-101、AB-8、LSA-21 各2 g，加入100 mL 具塞三角瓶中，然后加入40 mL 总皂苷浓度为1.385 mg/mL的刺玫果总皂苷提取液，每10 min 振摇一次约30 s，共2 h；静置48 h，过滤.分别吸取各树脂吸附后的药液0.1 mL，在544 nm 处测量吸光度，计算各树脂对刺玫果总皂苷的吸附率.将静态吸附的树脂抽滤至干，加入具塞三角瓶中，然后加入95%乙醇100 mL 进行解吸，每10 min 振摇一次，每次30 s，持续2 h，静置48 h，过滤.分别吸取各解吸液0.5 mL，于544 nm 处测定吸光度，计算各种树脂对刺玫果总皂苷的解吸率[13].6 种大孔吸附树脂对刺玫果总皂苷的静态吸附及解吸的试验结果见表1.

表1 6 种大孔树脂对刺玫果总皂苷的吸附率与解吸率

由表1 可知，以解吸率为考察指标，D-101、LX-36、LSA-10 3 种树脂的解吸率均高于50%，所以选择上述3 种树脂进行进一步研究.

2.2 动态吸附及动态解吸考察

取处理后的湿树脂LX-36、LSA-10、D-101 各4 g，湿法装柱，分别加入30 mL 总皂苷浓度为6.714 mg/mL 的刺玫果总皂苷提取液，以2 BV/h的流速进行动态吸附，待充分吸附后，收集吸附后的溶液，于544 nm 处测定吸光度，计算各树脂对刺玫果总皂苷的吸附率.然后再用50 mL 95%乙醇以2 BV/h 的流速进行动态解吸，分别收集各解吸液，于544 nm 处测定吸光度，计算各种树脂对刺玫果总皂苷的解吸率.3 种大孔吸附树脂对刺玫果总皂苷的动态吸附及解吸的试验结果见表2.

表2 3 种树脂对刺玫果总皂苷的动态吸附与解吸

由表2 可以看出，以解吸率作为考察指标，在所考察的树脂中，D-101 型大孔吸附树脂的解吸率和吸附率相对较高，故选择D-101 型树脂进行进一步工艺优化研究.

2.3 D-101 型大孔吸附树脂的吸附工艺优化[14]

2.3.1 上样药液浓度的考察

取已处理好的D-101 型吸附树脂5 份，各6 g，湿法装柱（玻璃树脂柱直径为2 cm），分别加入刺玫果提取原液（总皂苷浓度为34.09 mg/mL）以及分别稀释5、10、15、20 倍的刺玫果总皂苷提取液各30 mL，先以2 BV/h 的流速进行吸附，待充分吸附后，分别收集吸附后药液并记录体积，于544 nm 处测定吸光度，计算各树脂对刺玫果总皂苷的吸附率.然后以75%乙醇各50 mL 以2 BV/h 的流速进行解吸，分别收集解吸液并记录体积，于544 nm 处测定吸光度，计算解吸率.总皂苷提取液浓度对刺玫果总皂苷纯化效果的影响见表3.

表3 上样浓度对刺玫果总皂苷纯化效果的影响

由表3 可以看出，以解吸率为主要考察指标，在其他条件相同时，随着总皂苷提取液浓度的减小，解吸率先增大后又减小，稀释10 倍的样品溶液的解吸率最高，所以总皂苷提取液最佳上样浓度为原液稀释10 倍浓度，即用浓度相当于原生药0.02 g/mL 的药液上柱即可.

2.3.2 吸附速率的考察

取已处理好的D-101 型吸附树脂5 份，各6 g，湿法装柱，分别加入刺玫果总皂苷提取液（皂苷浓度为3.409 mg/mL）各25 mL，分别以1、2、3、4、5 BV/h 的流速进行吸附，待充分吸附后，分别收集吸附后药液并记录体积，于544 nm 处测定吸光度，计算各树脂对刺玫果总皂苷的吸附率.然后以75%乙醇各50 mL 以2 BV/h 的流速进行解吸，分别收集解吸液并记录体积，于544 nm 处测定吸光度，计算解吸率.吸附速率对刺玫果总皂苷刺玫果总皂苷纯化效果的影响见表4.

由表4 可以看出，以解吸率为主要考察指标，在其他条件相同时，随着吸附速率增大，解吸率先增大后减小，最佳吸附速率为3 BV/h.

2.3.3 解吸液浓度的考察

取已处理好的D-101 型吸附树脂5 份，各6 g，湿法装柱，分别加入刺玫果总皂苷提取液（皂苷浓度为3.409 mg/mL）各25 mL，以3 BV/h 的流速进行吸附，待充分吸附后，收集吸附后药液并记录体积，于544 nm 处测定吸光度，计算各树脂对刺玫果总皂苷的吸附率.然后分别以10%、30%、50%、75%、95%乙醇各40 mL 以2 BV/h 的流速进行解吸，分别收集解吸液并记录体积，于544 nm 处测定吸光度，计算解吸率.解吸液浓度对刺玫果总皂苷纯化效果的影响见表5.

表4 吸附速率对刺玫果总皂苷纯化效果的影响

表5 解吸液浓度对刺玫果总皂苷纯化效果的影响

由表5 可以看出，以解吸率为主要考察指标，在其他条件相同时，随着解吸液乙醇浓度的增大，解吸率不断增大，最佳解吸液乙醇浓度为95%.

2.3.4 解吸速率的考察

取已处理好的D-101 型吸附树脂5 份，各6 g，湿法装柱，分别加入刺玫果总皂苷提取液（皂苷浓度为3.409 mg/mL）各25 mL，以3 BV/h 的流速进行吸附，待充分吸附后，收集吸附后药液并记录体积，于544 nm 处测定吸光度，计算各树脂对刺玫果总皂苷的吸附率.然后以95%乙醇各40 mL，分别以1、2、3、4、5 BV/h 的流速进行洗脱，分别收集洗脱液并记录体积，于544 nm 处测定吸光度，计算解吸率.解吸速率对刺玫果总皂苷纯化效果的影响见表6.

结果表明，以解吸率为主要考察指标，在其他条件相同时，随着解吸速率的增大，解吸率先增大后减小，最佳解吸速率为3 BV/h.

2.3.5 洗脱终点考察

取已处理好的D-101 型吸附树脂6 g，湿法装柱，加入刺玫果总皂苷提取液（皂苷浓度为3.409 mg/mL）25 mL，以3 BV/h 的流速进行吸附，待充分吸附后，收集吸附后液并记录体积，计算吸附率.然后用95%乙醇以3 BV/h 的流速进行解吸，分别按0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、8.0、10.0 个树脂床体积收集解吸液，于544 nm 处测定吸光度，计算解吸液中总皂苷的含量，结果见图1.

表6 解吸速率对刺玫果总皂苷纯化效果的影响

图1 洗脱终点考察结果

从图1 可以看出，解吸液中总皂苷浓度随解吸液用量呈显著下降趋势，当洗脱液用量大于4 BV时，洗脱液中已检测不到皂苷，所以当洗脱液用量为4 BV 时，可以将总皂苷完全洗脱.

2.3.6 上柱药液pH 值的考察

取已处理好的D-101 型吸附树脂7 份，各6 g，湿法装柱，准备刺玫果总皂苷提取液（皂苷浓度为3.409 mg/mL）25 mL 7 份，用4%HCl 溶液和3%NaOH 溶液分别调pH 至2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，分别装入树脂柱内，以3 BV/h 的流速进行吸附，待充分吸附后，收集吸附后液并记录体积，于544 nm 处测定吸光度，计算各树脂对刺玫果总皂苷的吸附率.然后以95%乙醇各48 mL 以3 BV/h 的流速进行解吸，收集解吸液并记录体积，于544 nm 处测定吸光度，计算解吸率.总皂苷提取液pH 值对刺玫果总皂苷纯化效果的影响见表7.

表7 上柱药液pH 值对刺玫果总皂苷纯化效果的影响

由表7 可见，以解吸率为主要考察指标，在其他条件相同时，随着总皂苷提取液pH 值的增大，解吸率逐渐增大，但当总皂苷提取液pH 值大于9时，药液出现浑浊，影响含量测定结果，所以未考察pH 值大于9 时对纯化效果的影响，pH 值在8.5时解吸率最高，故刺玫果总皂苷提取液最佳pH 值确定为8.5.

2.4 D-101 型大孔吸附树脂纯化刺玫果总皂苷工艺验证

取已处理好的D-101 型吸附树脂3 份，各6 g，湿法装柱，分别加入pH 值为8.5 的刺玫果总皂苷提取液（皂苷浓度为3.409 mg/mL）各25 mL，以3 BV/h 的流速进行吸附，待充分吸附后，用48 mL 95%乙醇以3 BV/h 的流速进行洗脱，收集洗脱液，于544 nm 处测定吸光度，计算吸附率和解吸率.再各取50 mL 上柱液、45 mL 洗脱液倒入称重后的蒸发皿中水浴蒸干，基本蒸干后放入60 ℃的电热鼓风干燥箱中，待其干燥至恒重后称重，得浸膏质量，计算总皂苷的含量.按优化得到的纯化工艺进行3 次重复试验，经计算平均吸附率为92.79%，平均解吸率为71.66%，干膏中总皂苷含量平均为40.35%，结果见表8.

表8 D-101 型大孔吸附树脂纯化刺玫果总皂苷工艺验证试验

由表8 可以看出，经D-101 大孔吸附树脂处理刺玫果醇提液后，干膏中总皂苷含量由大约13%提高到40%左右，且具有较好的重现性.

2.5 树脂的重复使用

取已处理好的D-101 型吸附树脂6 g，湿法装柱，加入pH 值为8.5 的刺玫果总皂苷提取液（皂苷浓度为3.409 mg/mL）25 mL，以3 BV/h 的流速进行吸附，待充分吸附后，收集吸附后液并记录体积.以95%乙醇48 mL 以3 BV/h 的流速进行解吸，收集解吸液并记录体积，于544 nm 处测定吸光度，计算吸附率、解吸率和浸膏中总皂苷的含量，上述操作在同一根柱上重复操作5 次[15].试验结果见表9.

表9 D-101 型大孔吸附树脂重复使用试验

由表9 可见，D-101 型大孔吸附树脂重复使用5 次后，干浸膏的含量下降了8.70%，解吸率降低了32.28%，而重复使用3 次后，干浸膏的含量只下降了1.91%，解吸率降低了21.64%，所以建议使用D-101 型大孔吸附树脂纯化刺玫果总皂苷时，重复使用次数为3 次.

2.6 样品脱脂与未脱脂对比试验

称取粉碎后刺玫果50 g，使用石油醚30 mL回流脱脂2 次，每次30 min；除去石油醚后，分别加入8 倍生药量的80%乙醇，加热回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，放冷后过滤，取滤液减压蒸馏回收乙醇，浓缩至相对密度为1.31～1.35（60℃），蒸馏水定容至250 mL 容量瓶中，摇匀，得刺玫果提取原液，标号为A，备用.

称取粉碎后刺玫果5 g，分别加入8 倍生药量的80%乙醇，加热回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，放冷后过滤，取滤液减压蒸馏回收乙醇，浓缩至相对密度为1.31～1.35（60 ℃），蒸馏水定容至250 mL 容量瓶中，摇匀，得刺玫果提取原液，标号为B，备用.

称取粉碎后刺玫果5 g，分别加入8 倍生药量的80%乙醇85 ℃加热回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，放冷后过滤，取滤液减压蒸馏回收乙醇，浓缩至相对密度为1.31～1.35（60 ℃），使用石油醚萃取2 次，每次30 mL；弃除石油醚层，蒸馏水定容至250 mL 容量瓶中，摇匀，得刺玫果提取原液，标号为C，备用.

取已处理好的D-101 型吸附树脂3 份，各6 g，湿法装柱，分别加入pH 值为8.5 的刺玫果总皂苷提取液A、B、C，按“2.4”项的方法进行试验.结果表明，刺玫果是否脱脂及脱脂方式对解吸率和总皂苷纯度具有一定的影响，在其他条件相同时，未脱脂样与脱脂样比较，脱脂样的解吸率由69.13%提高到78.12%，干浸膏中总皂苷的含量由40.35%提高到45.56%；刺玫果脱脂样与提取液脱脂样比较，提取液脱脂样的解吸率由78.12%提高到82.37%，干浸膏中总皂苷的含量由45.56%提高到52.58%，由此可知将刺玫果加入8 倍生药量的80%乙醇加热回流提取后，用石油醚脱脂后，再按“2.4”所述的方法进行纯化，刺玫果干浸膏中总皂苷的含量可达到50%以上.

3 结论

对6 种不同型号的大孔吸附树脂进行了刺玫果总皂苷纯化试验，通过考察影响大孔吸附树脂吸附及解吸的各种因素，初步确定了D-101 型大孔吸附树脂分离纯化刺玫果总皂苷的效果比较理想，其最佳工艺为：将刺玫果加入8 倍生药量的80%乙醇加热回流提取后，制成药液浓度为0.02 mg/mL（相当于原生药）的上柱液，用石油醚脱脂，调药液pH 值为8.5，以3 BV/h 速率进行吸附，然后用95%乙醇以3 BV/h 的流速洗脱，干浸膏中总皂苷的含量由原来的13.17%提高到52.58%，树脂富集倍数为3.99 倍.试验表明，D-101 型大孔树脂对刺玫果总皂苷具有良好的纯化性能，为刺玫果总皂苷的工业化生产提供了理论依据.

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