放疗联合TK/GCV自杀基因系统对肺腺癌细胞凋亡活性的影响

康保国，陈 宏，杨 茜，曹学武，纪 华

(成都军区昆明总医院肿瘤科，昆明 650032)

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，近年来随着环境污染的不断加重，肺癌患者的数量逐年增加[1-2]。然而，常规的手术、放疗、化疗和生物治疗虽然在一定程度上延长了患者的生存期，但大部分患者最终由于肿瘤复发、转移而导致治疗失败，因此研究更加有效的肺癌治疗方法，对于延长患者生存期、提高患者的生存质量具有重要意义。本研究利用前期研究构建的同步放大基因电路系统提高目的基因胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因的表达，通过放疗联合TK/丙氧鸟苷(ganciclovir，GCV)自杀基因系统共同作用，促进肺腺癌细胞凋亡，以探寻肺癌治疗的新途径。

1 材料与方法

1.1材料 抗性筛选试剂G418为美国MBI公司产品，lipofectamine2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司，含10%胎牛血清的达尔伯克必需基本培养液为美国Gibco公司产品，凋亡检测试剂盒转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记(TUNEL)法购自瑞士Roche公司，人肺腺癌细胞株(A549细胞)为本科室储备。放射源：X射线(成都军区昆明总医院肿瘤放疗中心)。

1.2方法 将前期研究中构建的pfos-iNOS/TK治疗载体转染A549细胞。G418筛选阳性克隆。分别取转染治疗载体的细胞(转染治疗载体组)和未转染的对照细胞(未转染组)通过反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase/polymerase chain reaction,RT-PCR)检测细胞中TK基因的表达。将阳性转染细胞和未转染的A549细胞按0.6×104/孔。分别接种于4个96孔板,每板接种20孔，转染治疗载体组和未转染组各2个(并于1个未接种的孔内加入同种培养液作为空白孔)。其中，1个96孔板中转染pfos-iNOS/TK的A549细胞每孔中加入10 μmol/L GCV，1个未转染的A549细胞每孔中加入1000 μmol/L GCV；另外2个板给予2 Gy X射线照射，8 h后于受照射的培养板中每孔加入10 μmol/L GCV。于照射后36 h，轻轻吸弃培养板中培养液，枸橼酸盐缓冲液漂洗；干燥后，用4%多聚甲醛溶液固定，室温放置1 h。按照TUNEL法检测各组细胞的凋亡率[3]。光镜下观察细胞凋亡百分率,至少观察5个视野,计数200个细胞，计数各组表达阳性细胞百分比。

2 结 果

2.1治疗载体在转染细胞基因组内整合检测 取转染治疗载体及未转染A549细胞提取RNA，经RT-PCR反应、电泳、凝胶成像结果见图1。在转染细胞中RT-PCR检测到转染的TK基因片段，而未转染的A549细胞中只能检测到内参，未检测到TK基因。

a.未转染细胞 b.转染细胞 c.空白对照图1 RT-PCR检测目的基因TK在转染细胞和未转染细胞中的表达

2.2GCV对转染治疗载体组和未转染组细胞凋亡的影响 转染治疗载体组的细胞给予10 μmol/L GCV即可检测到细胞凋亡，但凋亡率较低，为(16.8±0.52)%(图2，见封三)；未转染的A549细胞给予1000 μmol/L GCV仅可观测到极少的细胞发生凋亡，为(6.2±0.61)%(图3，见封三)。转染治疗载体组与未转染组细胞凋亡率比较差异有统计学意义(t=2.086，P=0.025)。

2.3放疗联合GCV对转染细胞和未转染细胞凋亡活性的影响 两种细胞都给予2 Gy X射线照射联合GCV作用后，转染治疗载体组大量细胞发生凋亡，凋亡率为(86.58±0.83)%(图4，见封三)，而未转染组仅有少量细胞发生凋亡，凋亡率为(28.3±0.69)%(图5，见封三)，转染治疗载体组与未转染组细胞凋亡率比较差异有统计学意义(t=3.012，P=0.005)。

3 讨 论

由于环境污染的不断加重及肺癌诊断水平的提高，近年来肺癌的发病率不断增加[4]。虽然生物靶向治疗药物的出现给肺癌患者提供了新的治疗选择，但并没有从根本上有效降低肺癌的病死率。TK/GCV自杀基因系统通过将前药酶基因导入细胞后能够编码相应的酶，后者可将一些无毒或低毒的物质(GCV)代谢成具有毒性的物质，从而导致瘤细胞死亡[5-6]。然而，单纯TK/GCV自杀基因系统的临床疗效通常不十分理想,主要原因之一是经基因转导的肿瘤细胞，TK表达水平低且仅限于部分肿瘤细胞；另外，有效剂量的GCV[100 mg(kg·d)]对机体可能产生严重的毒性效应,主要并发症有肾功能受损(40%～60%)和骨髓抑制(20%～41%)等[7],限制了TK基因治疗的疗效和应用范围。前期研究证实,通过放射诱导的同步放大基因电路系统可以调控目的基因TK高效、特异性表达，从而解决了基因表达效率低、特异性差的问题[1]。

本研究中，转染治疗载体细胞内通过RT-PCR检测到TK基因的表达，而未转染细胞内无TK基因表达，说明TK基因与被转染细胞基因成功整合。转染治疗载体组的细胞给予10 μmol/L GCV即可检测到细胞凋亡，但凋亡率较低，再一次证实了单纯TK/GCV自杀基因系统诱导细胞凋亡的效率低[8]。给予2 Gy X射线照射联合GCV作用后，转染治疗载体组大量细胞发生凋亡，究其原因:一方面，X射线激活放射诱导的同步放大基因电路，显著提高了TK/GCV自杀基因系统的杀伤效率，另一方面，高浓度的一氧化氮既有直接的瘤细胞杀伤作用，又可以提高瘤细胞的放疗敏感性[9-10]。这样，由X射线、GCV、一氧化氮三者共同作用，进一步提高了肺癌细胞的凋亡比率。

有关基因治疗的试验研究层出不穷，预期效果也令人满意，但真正应用到临床治疗当中带来的治疗获益比并不高[11]。这可能与基因治疗技术中存在的基因靶向转移困难、基因表达水平低且短暂、转移后基因表达缺乏有效的调控手段以及肿瘤病因复杂而缺乏有效目的基因等因素有关[12]。因此，研究开发转染效率更强、特异性更高的载体和调控更加精细、准确的转录序列将使更多的肺癌患者受益于肿瘤基因治疗。

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