白藜芦醇对果蝇寿命影响及抗氧化机制研究

付 晖，肖建民

(1.广东医学院药理教研室，广东 东莞 523808； 2.东莞市太平人民医院心血管内科，广东 东莞 523905)

白藜芦醇又名芪三酚，是含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，广泛存在于葡萄、松树、虎杖、决明子以及花生等天然植物或果实中，到目前为止至少在21科、31属的72种植物中发现。白藜芦醇是许多植物受到生物或非生物胁迫(如真菌感染、紫外照射等)时产生的一种植物抗毒素，其具有很强的生物学作用，同时也是一种天然的抗氧化剂，其作用范围比较广泛[1]。近年来研究发现，白藜芦醇具有抗癌、保护心血管、抗血栓、抗氧化、抗菌、抗病毒及延长寿命等作用[2-8]。此外，白藜芦醇还能减轻多种因素所导致的组织器官损伤，并具有保护肝细胞的作用[9-10]。本研究拟进一步探讨白藜芦醇对果蝇寿命的影响及其抗氧化作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物 本研究所用果蝇为野生型Oregon K品系黑腹果蝇，由华中师范大学提供，在本实验室扩大繁殖并备用。实验室室温为20～25 ℃，生化培养箱温度(25±1) ℃，湿度为45%～65%。果蝇的培养液为含有玉米、糖、干酵母和琼脂的玉米饮食，标准饮食含有10%糖、10%酵母以及1.5%琼脂。本研究所用小鼠为雄性清洁级成年昆明种小鼠100只。

1.2实验仪器和试剂 实验仪器：生化培养箱(上海博讯，SPX-150BZ)、组织匀浆器、离心机、振荡器、移液泵、沸水浴、多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)、电子天平。试剂：血清/组织丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)测定试剂盒均购自南京建成生物试剂公司；白藜芦醇(纯度>99%)由上海纳贝生物技术有限公司提供。

1.3方法

1.3.1果蝇的生存实验 收集8 h内新羽化的果蝇成虫，用CO2麻醉后将雌雄分开，用普通培养液饲养14 d。取14 d龄的备用果蝇，采用计算机随机分组法分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组雄性果蝇100～120只，雌性果蝇150～200只。对照组用普通培养液培养，3个实验组用含有不同浓度的白藜芦醇培养液培养，其中低剂量组的剂量为100 μmol/L，中剂量组为200 μmol/L，高剂量组为400 μmol/L。记录每24小时果蝇的死亡只数，每4天更换1次培养液，直至果蝇全部死亡，分别计算果蝇平均寿命、平均最高寿命、半数死亡时间等指标。平均寿命是每组果蝇死亡日龄的算术平均数，平均最高寿命为每组最后10只果蝇死亡日龄的算术平均数，半数死亡时间为每组50%的果蝇死亡时的日龄。

1.3.2抗氧化实验 将100只健康雄性小鼠(月龄1.5～2.5个月)按随机数字表法分为空白对照组、溴代苯模型对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组20只，每组小鼠体质量、平均体质量及月龄，平均月龄情况分别为：对照组19.8～28.5(24.2±3.5) g，1.5～2.4(1.9±0.3)个月；模型组20.1～28.0(23.9±3.7) g，1.6～2.5(2.1±0.4)个月；低剂量组21.1～29.1(25.2±3.6) g，1.5～2.5(2.0±0.4)个月；中剂量组21.3～29.4(25.5±4.0) g，1.6～2.5(2.1±0.4)个月；高剂量组19.3～29.2(24.7±4.3) g，1.5～2.4(1.9±0.3) 个月，各组间小鼠体质量及月龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)具有均衡性。3个给药组分别予以低、中、高不同剂量的白藜芦醇[分别为22 mg/(kg·d)，44 mg/(kg·d)，88 mg/(kg·d)]连续灌胃30 d。30 d后取血检测抗氧化酶水平，包括全血GSH-Px、SOD及MDA，然后将动物饥饿过夜。第2日除空白对照组外，各组小鼠均经口给予溴代苯油0.47 g/kg，灌胃量0.2 mL/20 g，制造肝脏脂质过氧化损伤模型。20 h后处死动物，取肝组织测MDA水平和抗氧化酶活力。

1.3.3抗氧化能力测定指标

1.3.3.1血清样品 双侧眼眶内眦部位取血0.5 mL，以离心半径16 cm、2000 r/min离心15 min，取上清备用。

1.3.3.2全血样品 取肝素抗凝全血10 μL，以蒸馏水稀释至1 mL，配成1∶99的溶血液。充分混匀，放置5 min直至玻璃管中的溶血液对光呈完全透明状，4 ℃冰箱保存，2～3 d内测全血GSH-Px酶活性。

1.3.3.3肝组织上清液 动物处死后立即取出所需肝脏，放入冷生理盐水中洗去浮血。剔除脂肪及结缔组织，滤纸吸干后在冰浴上剪成碎片。称取适量组织，以组织匀浆器匀浆10 s，间歇10 s，反复3次制成10%组织匀浆，然后以离心半径16 cm、12500 r/min离心10 min，取上清液备用，操作均在冰浴中进行。

1.3.3.4各项指标测定 测定全血GSH-Px的水平、血清SOD和MDA及肝组织中GSH-Px、MDA和SOD的水平。检测方法完全按试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1不同浓度的白藜芦醇对果蝇寿命的影响 对照组和白藜芦、低、中、高剂量组果蝇的半数死亡时间分别为52、55、59及62 d；对照组和白藜芦醇低、中、高剂量组的寿命及最高寿命比较差异均有统计学意义(P<0.05)，其中高剂量组果蝇的寿命均显著高于中、低剂量组及对照组(P<0.05)，而中剂量组显著高于低剂量组与对照组(P<0.05)，低剂量组显著高于对照组(P<0.05)(表1-1、表1-2)。

表1-1 不同浓度的白藜芦醇对果蝇寿命的影响 (d)

表1-2 不同浓度的白藜芦醇对果蝇寿命影响的两两比较结果

2.2不同浓度的白藜芦醇对正常小鼠抗氧化能力的影响 小鼠全血/血清标本来自于溴代苯造模前，其检测的是白藜芦醇对正常小鼠抗氧化能力的影响，此时模型组与空白对照组重复，因此本结果只比较空白对照组与3个给药组。4组小鼠血中GSH-Px、SOD及MDA的水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其中低剂量组的GSH-Px、SOD及MDA与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；中、高剂量组小鼠的GSH-Px与SOD水平显著高于空白对照组，高剂量组MDA的水平显著低于空白对照组(P<0.05)，中剂量组与空白对照组比较无统计学意义(P>0.05)。中剂量组小鼠GSH-Px、SOD及MDA的水平与低剂量组比较无统计学意义(P>0.05)，而高剂量组与低剂量组比较有统计学意义(P<0.05)。高剂量组的GSH-Px及MDA与中剂量组比较有统计学意义，SOD比较无统计学意义(P>0.05)(表2-1，表2-2)。

2.3不同浓度的白藜芦醇对肝脏脂质过氧化损伤模型小鼠抗氧化能力的影响 溴代苯造模后，与空白对照组相比，模型对照组小鼠肝脏GSH-Px和SOD水平降低，而MDA水平升高，提示造模成功。模型组及白藜芦醇各剂量组肝脏GSH-Px、SOD及MDA比较差异有统计学意义(P<0.05)；其中高、中、低剂量组GSH-Px、SOD及MDA与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；中剂量组GSH-Px、SOD的水平与低剂量组比较无统计学意义(P>0.05)，而MDA比较有统计学意义(P<0.05)，高剂量组的GSH-Px、SOD及MDA与模型组比较有统计学意义(P<0.05)；高剂量组的GSH-Px水平显著高于中剂量组，肝组织MDA水平显著低于中剂量组(P<0.05)，SOD的水平比较差异无统计学意义(P>0.05)(表3-1、表3-2)。

表2-1 不同浓度的白藜芦醇对正常小鼠抗氧化能力的影响

表2-2 不同浓度的白藜芦醇对正常小鼠

表3-1 不同浓度的白藜芦醇对肝脏脂质过氧化

表3-2 不同浓度的白藜芦醇对肝脏脂质过氧化损伤模型小鼠

4 讨 论

近年来，白藜芦醇在抗氧化方面的作用越来越引起研究人员的注意，通过研究其抗氧化作用机制对于防治心脑血管系统的氧化自由基损伤具有积极意义。

机体衰老是自然界的必然过程，现在比较公认的衰老的自由基学说是Harman[11]在1956年提出的，他认为机体的衰老主要与自由基的生成、机体本身对自由基的反应以及抗氧化失衡等有关。衰老过程中的退行性变是细胞正常代谢过程中产生的自由基的有害作用造成的，是机体组织细胞不断产生的自由基积累的结果。随着年龄增加，细胞内有害物质逐渐堆积。自由基是正常代谢的中间产物，其可使细胞内的多种物质发生氧化，损害生物膜；还能够使蛋白质、核酸等大分子交联，引起DNA损伤，影响其正常功能；细胞损伤后又会产生更多的有害物质，使更多的细胞受损，从而形成一种恶性循环，最终导致机体死亡，寿命缩短[12]。由此推测，给予自由基抑制剂及抗氧化剂可以延缓细胞衰老、延长寿命。

白藜芦醇主要是通过清除或抑制自由基的生成、调节与抗氧化有关的酶的活性等发挥抗氧化作用。白藜芦醇具有广泛的抗氧化作用，能清除氧自由基，减轻氧化应激损伤。Zini等[13]发现，白藜芦醇(<0.1 mmol/L)能部分逆转缺氧再通氧造成的呼吸控制率降低，且浓度依赖性地抑制细胞色素C释放；1 nmol/L的白藜芦醇可减少超氧阴离子的产生；0.1 mmol/L的白藜芦醇还能部分保护缺氧再通造成的线粒体膜损伤。这些作用与白藜芦醇所具有的抗氧化能力密不可分。本研究发现，添加不同浓度白藜芦醇的培养液喂养的果蝇的平均寿命、平均最高寿命、半数死亡的时间较普通培养液喂养的都有所延长，并且随着白藜芦醇浓度的增高，所延长的时间越久。研究数据表明白藜芦醇能够浓度依赖性地延长果蝇寿命。同时，白藜芦醇能够提高脂质过氧化损伤模型小鼠体内的SOD、GSH-Px活性，降低体内MDA水平，提示白藜芦醇可增加模型小鼠抗氧化酶活力，减少过氧化损伤。说明白藜芦醇能够保护并增强机体抗氧化酶类的活性，抑制体内的脂质过氧化，纠正机体自由基的代谢紊乱，维持机体氧化和抗氧化能力的平衡，对心脑血管起到保护作用，这也可能是其延长寿命的机制之一。

白藜芦醇可提高机体抗氧化酶活性，同时降低脂质过氧化损伤，这可能是其浓度依赖性延长果蝇寿命的机制之一。白藜芦醇的抗氧化作用和清除自由基的作用与人体多种疾病的关系密切，本研究仅就白藜芦醇对寿命的影响和抗氧化的机制进行初步研究，其具体作用机制还有待进一步完善研究与探索。

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