荧光法测定蒜头果蛋白中Trp的含量

袁 燕，张 薇，戴建辉，陈磊，钱吉花，殷兆福

(云南民族大学 云南省生物高分子功能材料工程技术研究中心，云南 昆明 650500)

色氨酸(Trp)是食物中含量较少且在体内又无法自行合成的“必需氨基酸”，它对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸[1].色氨酸测定方法主要有纸层析法、荧光法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用、质谱-质谱联用、毛细管电泳、酶/比色法以及酶电极法等[2-3].由于Trp在受到紫外光照射后，会产生比激发波长更长的荧光信号，所以利用Trp的荧光特性，可以用简便、快捷、高灵敏度的荧光光谱分析方法来检测Trp的含量[4].

蒜头果(MalaniaoleiferaChunet S. Lee)属于铁青树科蒜头果属[5]，是中国特有单种属稀有植物，国家二级保护树种，广西重点保护野生植物[6-7].蒜头果蛋白(malanin)是从云南广西特有植物蒜头果中分离、纯化出的一种新的、具有抗肿瘤活性的蛋白质[8]，该蛋白是一种糖蛋白，相对分子质量为 61 875，由A、B两条链通过二硫键连接而成.由于在通常的氨基酸分析中一般都使用酸水解蛋白质，但是在酸水解条件下，Trp极易被破坏，故在氨基酸分析测定中无Trp的含量数据，而需要单独测试[9].本研究以NaOH为水解液，利用荧光法测定malanin中Trp的含量，为malanin全序列的测定提供参考数据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

malanin由本课题组制备；L-色氨酸为上海生物工程技术有限公司产品；其它试剂均为国产分析纯；所有水均为Milli-Q纯水.

1.2 仪器

F-4500荧光分光光度计(HITACHI公司)；Milli-Q纯水机(MILLIRORE公司)；万分之一天平(Sartorius, BP110S).

1.3 实验方法

1.3.1 Trp标准系列溶液配制

准确称取色氨酸10 mg，加蒸馏水溶解，定容至10 mL，此溶液质量浓度即为1 mg·mL-1.在7支试管中分别加入1 mg·mL-1Trp溶液0.00、0.05、0.10、0.20、0.25、0.30和0.35 mL，再用pH=10.5的KH2PO4- NaOH缓冲液定容至5 mL，则Trp标准溶液的质量浓度分别为0.00、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 mg·L-1.

1.3.2 荧光光谱测定

选用激发波长225 nm，在290～450 nm扫描荧光光谱，于发射波长350 nm处读取荧光强度值.激发光谱狭缝宽度为5 nm，发射光谱狭缝宽度为10 nm，高速扫描，以Trp标准溶液浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制标准曲线[10].如图1所示，可见Trp在0.00～0.07 mg·L-1范围内线性良好.

1.3.3 Malanin样品的水解

称取5 mg malanin于水解管内，加入新配制的含0.5%可溶性淀粉的6.0 mol·L-1NaOH溶液5 mL，向水解管充纯氮3 min后封口，在烘箱中110 ℃水解20 h 后，放置于暗处冷却至室温[11].

将水解产物转移至已加有5.0 mL 6 mol·L-1HCl的50 mL容量瓶中，用纯水反复冲洗水解管5～6次后加入l 滴 0. l %的酚酞溶液，然后用6 mol·L-1HCl调溶液至无色，再用l mol·L-1NaOH 滴定至溶液呈粉红色，用纯水定容.取1 mL样品于5 mL刻度管中，用pH 10.5的KH2PO4-NaOH 缓冲液定容后摇匀，即为样品待测液.

1.3.4 样品中Trp含量的测定

样品待测液按照1.3.2的实验方法进行，选用225 nm为激发波长，350 nm为发射波长进行荧光测定.

1.3.5 样品中Trp含量的计算采用标准曲线法[10].

2 结果与分析

2.1 Trp标准曲线

以Trp标准溶液质量浓度(mg·L-1)为横坐标，荧光强度为纵坐标得到线性回归方程为y= 818 9x+24.23 (R2=0.998 5)(图1).结果表明，在0.00～0.07 mg·L-1线性范围内，Trp标准溶液质量浓度与荧光强度呈良好的线性关系.

2.2 NaOH水解液浓度的选择

为研究NaOH的水解条件对malanin水解产生Trp量的影响，本研究分别向5 mg malanin中加入5 mL不同浓度的NaOH进行水解，其结果如图2所示，可见NaOH浓度在5.5～7.0 mol·L-1范围内较好，故本实验选用6.0 mol·L-1.

2.3 Malanin中Trp的含量测定

根据回归方程及含量公式可以计算得出malanin中Trp的含量为5.116 mg·g-1，即每分子malanin中含Trp约为4个.

2.4 检测限和精密度试验

在最佳试验条件下，对0.05 mg·L-1的Trp标准溶液连续测定8次，由荧光信号强度的标准差的3倍与工作曲线斜率之比，得检测限为0.002 mg·L-1.对malanin连续取样测定8次，相对标准偏差(RSD)为1.82%.

2.5 样品重现性和回收率试验

取5.0 mg左右的malanin样品6份，按上述水解法处理，仪器条件同上，测定结果如表1所示.重现性试验的相对标准偏差为1.05%，结果表明重现性较好.

在malanin待测液中进行加标回收实验，计算得到的回收率结果如表2，回收率在96.1%～100.1%之间，说明准确度较好，达到了分析实验的要求.

表1 重现性试验

表2 回收率试验

3 结语

由于蛋白质的氨基酸组成测定的水解方法主要是酸水解，同时辅以碱水解.酸水解虽然不引起消旋作用，得到的是L-氨基酸，但Trp却完全被沸酸所破坏，羟基氨基酸(丝氨酸及苏氨酸)有一小部分被分解，同时天冬酰胺和谷胺酰胺的酰胺基也被水解下来.为测定Trp含量，蛋白质可用碱水解，虽然水解过程中多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且会产生消旋现象，所得产物是D型和L型氨基酸的混合物，但Trp在碱性条件下却是稳定的，可以定量回收[12].故本研究以NaOH为水解液，利用荧光法测定malanin中Trp的含量，得出malanin中Trp含量为5.116 mg·g-1，即每分子malanin中含Trp约为4个，此结果为酸水解测定malanin氨基酸的组成作为补充，同时也为malanin全序列的测定提供较好的参考数据.

参考文献:

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[3] 高春, 周淑平, 李群, 等. 18种复合氨基酸注射液中N-乙酰-L-酪氨酸及L -色氨酸含量测定方法的研究[J]. 中国生化药学杂志, 1998, 19, 3.

[4] 吴芳, 郭卫东, 张润, 等. 荧光法测定微藻中色氨酸的含量[J].海洋科学, 2005, 29(10)：1-4.

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[10] 任大喜, 提伟钢, 李景红, 等. 荧光法测定婴儿奶粉中色氨酸的含量[J]. 食品工业科技, 2007, 28(7)：203-204.

[11] 刘惠容, 张双峰. 玉米子实中色氨酸的测定[J]. 陕西农业大学, 1987, 3:34-36.

[12] 沈同, 王镜岩. 生物化学[M]. 2版.北京:高等教育出版社, 2002：121.