束缚应激后大鼠肝脏PPARβ/δ mRNA和蛋白表达的变化

任冰稳，叶 平，田海涛

现代社会人们受到的应激因素增加，糖尿病、动脉粥样硬化、血脂紊乱等代谢疾病发生率明显升高。流行病学研究发现，应激与代谢疾病的发生关系密切[1-2]，但分子机制并不清楚。过氧化物酶体增殖物激活因子(peroxisome proliferator activated receptors，PPARs)属于细胞核甾体类受体超家族，根据结构和功能分为PPARα、PPARβ/δ、PPARγ三种亚型。近年的研究发现，PPARβ/δ在调节脂质代谢、改善胰岛素敏感性中发挥重要作用，有望成为高脂血症、2型糖尿病治疗新靶点[3]。

肝脏是调节机体能量代谢的重要器官，三种PPARs在肝脏均有不同程度的表达，其中PPARβ/δ含量丰富，许多葡萄糖和脂肪酸代谢基因受PPARβ/δ影响明显。本研究以束缚应激大鼠为模型，观察束缚应激对大鼠血TG、血糖及肝脏中PPARβ/δ表达的影响，初步探讨应激时代谢异常发生的可能机制。

1 材料与方法

1.1材料 引物由北京赛百盛生物公司合成，DNA marker购自北京天根生化科技公司，RNA-Trizol购自Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒购自大连Takara公司，羊抗鼠PPARβ/δ一抗、羊抗鼠GAPDH一抗、HRP兔抗羊二抗均购自Santa Cruz公司。

1.2实验方法

1.2.1动物分组及处理 健康雄性Wistar大鼠32只，由军事医学科学院动物实验中心提供(合格证号为SCXK-军2007-004)，适应喂养1 w后，参考文献[4-5]方法，按体重随机分为4组：正常对照组(C)、束缚1 w组(R1)、束缚2 w组(R2)和束缚4 w组(R4)。实验周期为4 w。对照组大鼠行抓取动作后放入饲养笼内，R4组大鼠进行束缚应激4 w；R2组大鼠前2 w处理同对照组，第3 w开始接受束缚应激2 w；R1组前3 w处理同对照组，第4 w时进行应激1 w。应激在9：00～12：00和14：00～17：00进行，期间所有大鼠均禁食、水。试验结束后，大鼠麻醉后下腔静脉取血，静置离心取上清。用全自动生化分析仪测定大鼠血TG、血糖水平；血清皮质酮浓度采用放免法测定，血清去甲肾上腺素浓度采用酶联免疫吸附测定，血清胰岛素采用放免法测定，均严格按说明书进行。胰岛素敏感指数(ISI)=In1/(空腹血糖×空腹胰岛素)。迅速取出肝脏，置液氮中冻存备用。

1.2.2PPARβ/δ mRNA表达测定 参考文献[5]方法，迅速取出保存在液氮中的各组肝组织样本，采用Trizol试剂一步法提取细胞总RNA。严格按照RT-PCR试剂盒说明书中的程序操作，先将各组RNA逆转录为cDNA，再配PCR反应体系扩增PPARβ/δ(上游引物为5'-ATCGGCCTGGCCTTCTAAAC-3'，下游引物为5'-GTCTCTGTAGATCTCTTGC-3'，扩增片段为239 bp)、内参照物GAPDH(上游引物为5'-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3'，下游引物为5'-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3'，扩增片段为196 bp)，按照扩增条件扩增cDNA。将反应产物经2%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5 mg/L)电泳后，用GelDoc2000凝胶图像分析系统计算PPARβ/δ与GAPDH的光密度值，各组肝组织PPARβ/δ mRNA的相对表达量以两者的比值(OD值)表示。

1.2.3PPARβ/δ蛋白表达测定(Western blot) (1)提取肝脏组织总蛋白：按照100 mg肝组织加入500 μl的比例加入蛋白提取液，冰上充分研磨并静置30 min后，12 000 r/min离心15 min。取上清液，按1∶4的比例加入上样缓冲液后煮5 min，于-20 ℃冰箱备用。(2)电泳及转移蛋白：测定样品蛋白含量后，各组样品按照20 μg的上样量，先进行聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，继之转移蛋白至硝酸纤维素膜上。(3)免疫反应：转移完成后，5%的脱脂奶粉封闭1 h，一抗中4 ℃过夜。用TBST洗膜后入二抗室温下孵育2 h，洗膜后暗室中超敏化学发光液显影，X线片压片曝光，用Image J图像分析软件分析结果，各样品的蛋白表达量以各目的条带与内参照的灰度值和面积的乘积之比表示。

2 结果

2.1束缚应激对大鼠血清皮质醇、去甲肾上腺素、胰岛素水平的影响 由表1可见，与C组大鼠相比，R1、R2、R4组大鼠血清皮质酮、去甲肾上腺素、胰岛素水平均升高(P<0.05或P<0.01)；但R1、R2、R4组间血清皮质酮、去甲肾上腺素、胰岛素无明显差异(P>0.05)。

表1 各组大鼠血清皮质醇、去甲肾上腺素、胰岛素浓度的比较(n=8)

2.2束缚应激对大鼠血TG、血糖和ISI的影响 由表2可见，与C组大鼠相比，R1、R2、R4组大鼠血清TG和血糖水平升高(P<0.01)，ISI明显降低(P<0.01)；但R1、R2、R4组间血清TG、血糖和ISI无明显差异(P>0.05)。

表2 各组大鼠血TG、血糖浓度和ISI的比较(n=8)

2.3束缚应激对大鼠肝脏PPARβ/δ mRNA表达的影响 结果见图1。由表3可见，与C组大鼠相比， R1、R2、R4组大鼠肝脏中PPARβ/δ mRNA表达降低(P<0.01)，但R1、R2、R4组间肝脏中PPARβ/δ mRNA表达无明显差异(P>0.05)。

表3 各组大鼠肝脏PPARβ/δ mRNA表达水平的比较(n=8)

图1 RT-PCR检测各组大鼠肝脏PPARβ/δ mRNA表达水平

2.4束缚应激对大鼠肝脏PPARβ/δ蛋白表达的影响 结果见图2。由表4可见，与C组大鼠相比，R1、R2、R4组大鼠肝脏中PPARβ/δ蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01)，但R1、R2、R4组间肝脏中PPARβ/δ蛋白表达无明显差异(P>0.05)。

表4 肝脏PPARβ/δ蛋白表达水平(灰度值，±s，n=8)

图2 Western blot检测各组大鼠肝脏PPARβ/δ蛋白表达水平

3 讨论

本研究发现，束缚应激大鼠皮质酮和去甲肾上腺素分泌增加，应激后神经内分泌的改变以交感神经兴奋和下丘脑-垂体-肾上腺激活为特征，这是应激后的非特异性反应，提示应激模型制作成功。

应激后机体处于高代谢状态，大脑中枢兴奋、血液循环加快、心脏负荷加重。本研究发现，束缚应激大鼠血甘油三酯、血糖升高，ISI降低。血糖、甘油三酯均是机体重要的能源物质，胰岛素敏感性下降有利于节省能源物质，为大脑中枢、红细胞等只能利用葡萄糖的器官和主要应激组织提供充足的能量供应。但是，长期循环中血糖和甘油三酯升高会对血管和组织器官造成损害，导致多种代谢性疾病的发生。

肝脏中PPARβ/δ含量丰富，包括脂质转运、脂肪酸和葡萄糖氧化利用、戊糖磷酸途径的多种基因受PPARβ/δ调控[6-7]。本研究发现，束缚应激导致肝脏中PPARβ/δ mRNA和蛋白表达下降。肝脏中PPARβ/δ mRNA和蛋白表达下降可能导致肝脏葡萄糖和脂肪酸利用减少，促进肝糖输出和TG、血糖升高。

束缚应激各组大鼠之间血TG、血糖、ISI水平无明显差异，肝脏PPARβ/δ mRNA和蛋白表达也无明显差异，提示束缚应激对大鼠血TG、血糖和肝脏PPARβ/δ表达的影响主要与束缚应激本身有关。

【参考文献】

[1] Brunner EJ,Kivimäki M.Epidemiology:work-related stress and the risk of type 2 diabetes mellitus[J].Nat Rev Endocrinol,2013,9(8):449-450.

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[3] Bojic LA,Huff MW.Peroxisome proliferator-activated receptor δ:a multifaceted metabolic player[J].Curr Opin Lipidol,2013,24(2):171-177.

[4] Mao YF,Zhang YL,Yu QH,et al.Chronic restraint stress aggravated arthritic joint swell of rats through regulating nitric oxide production[J].Nitric Oxide,2012,27(3):137-142.

[5] 任冰稳,叶平,刘永学,等.束缚应激对心脏PPARα、PPARβ和M-CPT-ⅠmRNA表达的影响[J].西南国防医药,2010,20(1)：178-181.

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[7] Tailleux A,Wouters K,Staels B.Roles of PPARs in NAFLD:potential therapeutic targets[J].Biochim Biophys Acta,2012,1821(5):809-818.