离子交换色谱法分离氨基酸实验方法的改进

李 欣，张宝珠，赵玉红，蔺宝珠，李登文，赵立青，张金红

(南开大学 生命科学学院，天津 300071)

基础生物化学实验是南开大学生命科学学院面向本校药学、医学、环境科学和物理专业低年级本科生开设的基础实验课程。该课程涉及到滴定技术、生物大分子的提取和分离技术等多项生物化学基本实验技能，每学期54学时，共11个实验项目，学生人数150～200人。与生命科学学院本专业的生物化学实验课不同的是：学生所学专业不一、理论基础和实验操作能力参差不齐，导致该课程形成时间紧、任务重的特点。

离子交换色谱法是分离和纯化生物分子的常用方法之一。由于其应用的重要性和广泛性，该方法也被引入本科生基础生物化学实验“离子交换色谱法分离氨基酸”实验中。氨基酸分离效果的优劣，一方面决定于待分离氨基酸等电点的差异，差异越大，分离效果越好[1-2]；另一方面，树脂的型号、缓冲液和洗脱液的种类及pH值、洗脱速度等因素都会影响分离效果[3-4]。由于天门冬氨酸(等电点为2.77)和精氨酸(等电点为10.76)的等电点相差较大，本实验依然沿用之前的实验选择，对它们的混合溶液进行分离。所不同的是，在之前的实验中，采用型号为001×7的离子交换树脂，NaCl作为洗脱溶液，出现洗脱难，耗时长的现象；而经过改进，选用具有“易洗脱”特点的D61树脂，并将洗脱液改为NaOH，大幅度地改变了氨基酸所处的pH环境。改进后的实验方法，不但使洗脱效果得以优化，还可以保证学生在规定时间内完成实验任务，保障了基础生物化学实验课程的进度安排，有利于在本科生实验教学中普及开展。

1 试剂和器材

试剂：盐酸、氢氧化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、天门冬氨酸、精氨酸、茚三酮、95%乙醇、α-萘酚、碱性次溴酸钠溶液(把1.2 g溴溶于150 mL、5%的NaOH中)、氯化钠、氢氧化钠等。

器材：强酸性离子交换树脂001×7和D61 (天津南开和成科技有限公司)、内径为1.9 cm的下阀有导管联通的色谱柱、铁架台、蠕动泵、分部收集器、广泛pH试纸、恒温水浴锅、分光光度计等。

2 实验方法

2.1 离子交换树脂的处理

新树脂先在蒸馏水中浸泡，洗去杂质和细小颗粒，再用2 mol/L的HCl浸泡4 h左右，除去可能含有的重金属离子；用蒸馏水洗至中性后，用2 mol/L的NaOH浸泡4 h左右，用蒸馏水洗至中性，树脂即转变为Na+型。装柱前，用0.05mol/L、pH6.0的柠檬酸缓冲液和树脂搅拌，达到平衡[5]。

2.2 装柱

将平衡好的阳离子交换树脂搅拌后装柱，使树脂悬浮液慢慢沉析，直到柱子的1/2左右，此时色谱柱中装树脂的高度约为9 cm，树脂体积约为25 mL。

2.3 加样

放出过量的缓冲液，当溶液的液面与柱床表面高度相同时，加入氨基酸混合液样品(天门冬氨酸和精氨酸，10g/L)1 mL，打开蠕动泵(流速0.6 mL/min)，使氨基酸混合液进入树脂，待液面与柱床表面接近相平时，吸取2～3 mL缓冲液洗涤树脂柱内壁，并重复2～3次，确保样品进柱[5]。

2.4 洗脱和收集

首先用0.05 mol/L、pH6.0的柠檬酸缓冲液以0.6 mL/min的流速洗脱，用试管进行收集，每3 mL收集1管，用茚三酮显色法进行检测。当第1种氨基酸被洗脱下来后，将洗脱液换成NaCl或NaOH，流速增加为1 mL/min，同样是每3 mL收集1管，直到第2种氨基酸被完全洗脱下来。

2.5 氨基酸的检查

从每支收集管中分别取350 μL收集液放入相应的1.5 mL炮弹管中，用试纸检测收集液的pH值并调节，使各管pH为6，再分别加入等体积的0.5%的茚三酮乙醇溶液，混匀后于沸水浴中加热10 min，如有氨基酸存在，溶液变成蓝色[5]。

2.6 精氨酸的检测

将500 μL收集液与500 μL、20%的NaOH混合，加入2滴α-萘酚，混合后加入1～2滴次溴酸钠，观察颜色变化，如果混合液变红，则说明有精氨酸存在[5]。

3 实验结果

树脂在先后两种不同洗脱液的作用下，使混合氨基酸得以分离。天门冬氨酸是酸性氨基酸，等电点为2.77；精氨酸为碱性氨基酸，等电点为10.76。实验中首先以0.05 mol/L、pH6.0的柠檬酸缓冲液作为洗脱液，此时，天门冬氨酸带负电，无法与阳离子交换树脂上的Na+进行交换，而此时带正电的精氨酸却可以和树脂结合，因此，在用0.05 mol/L、pH6.0的柠檬酸缓冲液来洗脱时，天门冬氨酸先被洗脱下来；随后，换用2 mol/L的NaCl 或1 mol/L的NaOH进行洗脱，使得盐浓度或pH大幅提高，精氨酸则与树脂脱离而被洗脱下来[6-11]。

选择001×7树脂分离两种氨基酸，以2 mol/L的NaCl作为洗脱液，洗脱结果如图1所示。

图1 001×7树脂以0.05 mol/L柠檬酸缓冲液和2 mol/L的NaCl为洗脱液的洗脱结果

从图1中可以看出，两种氨基酸均被洗脱下来。坂口反应是精氨酸的特征反应，用来检测精氨酸的存在。第1种被柠檬酸缓冲液洗脱下来的氨基酸坂口反应呈阴性，是天门冬氨酸，被收集在第3至7管中；第2种被2mol/L的NaCl洗脱下来的氨基酸坂口反应成阳性，是精氨酸，被收集在第19至42管中。

选择D61树脂分离两种氨基酸，以1 mol/L的NaOH作为洗脱液，洗脱结果如图2所示。

图2 D61树脂以0.05mol/L柠檬酸缓冲液和1mol/L的NaOH为洗脱液的洗脱结果

从图2 中可以看出，两种氨基酸同样被洗脱下来。第1种被柠檬酸缓冲液洗脱下来的氨基酸坂口反应呈阴性，是天门冬氨酸，被收集在第4至8管中；第2种被1mol/L的NaOH洗脱下来的氨基酸坂口反应成阳性，是精氨酸，被收集在第16至25管中。

比较两种实验方法得到的结果，选择001×7树脂以2 mol/L的NaCl作为洗脱液，分离得到的精氨酸被集中于24个管中，洗脱不集中，说明此时精氨酸不易被洗脱下来，耗费洗脱液体积较大，时间较长，严重影响到该实验的进度。而选择D61树脂以1 mol/L的NaOH作为洗脱液，分离得到的精氨酸被集中于仅仅10管中，洗脱集中，节省了洗脱液和洗脱时间，取得了良好的洗脱和分离效果，也大大提高了课堂实验教学效率。

4 讨论

(1) 实验所选用的D61树脂，是一种大孔的离子交换树脂，相比001×7树脂，具有容易洗脱的特点，改善了过去氨基酸分离效果差、难洗脱的现象，且价格便宜，实验成本低，有利于在实验教学中广泛使用。

(2) 实验中若使用001×7树脂，需要收集45管左右才能完成实验，而使用D61树脂，只需要收集30管左右即可。节省了实验时间，保证学生可以在规定时间内按时完成实验，保障了教学进度，提高了教学效率，符合基础生物化学实验的学时特点。

(3) 本实验中选择D61树脂并用NaOH作为精氨酸的洗脱液，虽然优于001×7树脂用2 mol/L的NaCl洗脱的效果，但也会带来新的问题。茚三酮反应的最适pH值为5～7，NaOH会使收集液pH大幅升高，影响到茚三酮显色。因此，在将收集液和茚三酮乙醇溶液混匀前，先要测定收集液的pH值，并将pH值调至6，和0.05 mol/L柠檬酸缓冲液的pH值一致，这样，既保证了显色条件和实验的平行性，同时也加深了学生对于茚三酮反应最适条件的理解。

5 结束语

通过本实验的改进，学生可以认识到对于离子交换色谱分离氨基酸的效果而言，装柱和加样技术的优劣、洗脱液的选择、洗脱速度的改变、pH值等因素都是至关重要的[12]。与此同时，让学生体会到实验方法并不是一成不变的，可以通过理论联系实际的逐渐摸索将方法不断优化，最终得到满意的实验结果。此过程中，不但调动了学生学习的积极性，激发了学生的学习兴趣，还为创新型人才的培养做出了新的尝试[13]。

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