茚三酮法测定茶叶游离氨基酸总量研究

涂云飞

摘要 鑒于茚三酮法测定游离氨基酸总量不够稳定，本文对茚三酮法测定茶游离氨基酸的显色反应时间与氨基酸浓度因素进行了条件优化，并考察了方法的准确度与精密度。结果表明，将200 μL的2×pH 5.6的缓冲液、200 μL水或茶叶水提取液（茶水比1∶250，沸煮30 min）和400 μL茚三酮溶液显色体系均匀混合，沸煮结束后立即用自来水充分冷却并加入4.8 mL去离子水，于570 nm处测定吸光值，所获得的结果稳定可靠，适宜作为茶叶中游离氨基酸总量的测定条件。

关键词 茶叶；游离氨基酸总量；茚三酮

中图分类号 TS272.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）14-0235-01

Abstract In this paper，ninhydrin reaction parameters for determination of total free amino acid in tea samples were optimized.The results indicated that，the method was stable and reliable in the following cases：200 μL buffer（2×pH 5.6），200 μL water or tea extraction aqueous（tea to water was 1∶250，boiling 30 min），and 400 μL ninhydrin solution mixed sufficiently in one system，after boiling，the reaction system was cooled by tap water and then added 4.8 mL deionized water to colorimetric analysis at 570 nm，which was suitable to determine the total free amino acid in tea.

Key words tea；total free amino acid；ninhydrin

茶叶中的游离氨基酸除了含有组成蛋白质常见的20种基酸外，还含有含量较为丰富的非蛋白质组成成分的茶氨酸及γ-氨基丁酸。这些氨基酸不仅影响茶叶的口感风味，而且还是对人体健康有益的重要因子。

茚三酮作为常见的试剂用于游离氨基酸总量的测定[1-5]，其原理是基于水合茚三酮首先与氨基酸反应形成还原型茚三酮和氨气，之后一分子水合茚三酮、一分子茚三酮和一分子氨气缩合成Ruhemann紫（一种氨盐）（图1）。

鉴于现有茶叶中游离氨基酸总量采用茚三酮法的测定条件不够稳定[6-10]，同时考虑到国标（GB/T 8314—2002、GB/T 8314—2013）的显色体系操作步骤过于烦琐。本文对试剂配制的简化作了有益尝试，并优化了显色反应体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

仪器设备：尤尼柯UV-2010紫外可见分光光度计。主要试剂：十二水合磷酸氢二钠（AR级，纯度≥99%，浙江湖州化学试剂厂）；一水合柠檬酸（AR级，纯度≥99.5%，成都市新都区木兰镇工业开发区）；茚三酮（AR级，纯度≥95%，国药集团化学试剂有限公司）；谷氨酸[（HPLC级，纯度≥98.5%，西格玛奥德里奇（sigma-aldrich）上海贸易有限公司]；去离子水（实验室自制）。

1.2 试验方法

1.2.1 试剂配制方法。①2×pH 5.6的缓冲液配制。将4.15 g十二水合磷酸氢二钠和0.88 g一水合柠檬酸溶解于50 mL容量瓶中，并用去离子水定容至刻度，混合摇匀备用。②茚三酮溶液的配制。1×pH 5.6的缓冲液溶解茚三酮并定容至2%（w/v）（注：溶解时加入<10%体积分数的乙醇助溶）。③谷氨酸标准溶液配制。准确称取0.1 g谷氨酸标准品，溶解并定容于100 mL容量瓶中，摇匀后备用。

1.2.2 谷氨酸标准曲线的制作。分别准确移取谷氨酸标准溶液1.6、3.2、6.4、12.8 mL至25 mL容量瓶中，并用去离子水定容至刻度，摇匀后备用。

10 mL具塞刻度玻璃试管中依次加入200 μL的2×pH 5.6的缓冲液、200 μL稀释后的谷氨酸标准溶液和400 μL茚三酮溶液，摇匀，沸煮结束后立即用自来水冷却后加入4.8 mL去离子水，于570 nm处测定吸光值。

1.2.3 茶叶样品测定体系。10 mL具塞刻度玻璃试管中依次加入200 μL的2×pH 5.6的缓冲液、200 μL水或茶叶水提取液（茶水比1∶250，沸煮30 min）和400 μL茚三酮溶液，摇匀，沸煮结束后立即用自来水冷却后加入4.8 mL去离子水，于570 nm处测定吸光值。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的谷氨酸标准溶液显色

在试验条件摸索的过程中发现，体系中若只加水不加缓冲液，需在长时间加热的条件下才能显浅紫色，且易褪色；这可能是因为在无缓冲体系的条件下，谷氨酸本身的pH值过低使反应难以进行。另外，若加pH 5.6的缓冲液反应后不立即冷却和用水稀释，则高浓度的谷氨酸标准液（如512 mg/L）反应会产生沉淀，且反应液变成黄红色。同时，试验过程中还发现，在无氯化亚锡或其他还原剂存在的条件下，显色反应即可进行，但保证氨基酸有效显色的前提是反应过程中需要沸煮和过量的茚三酮。

在稳定反应条件的基础上，谷氨酸标准溶液体系在加热5～30 min过程中均呈现出蓝紫色，但512 mg/L谷氨酸标准溶液显色时沸煮10 min以上即有细粒漂浮沉淀产生，且吸光值超过0.8，即浓度过高的氨基酸会对测定体系产生影响。由表1可知，在选定的64～256 mg/L谷氨酸标准溶液范围内，沸煮10～30 min后吸光值随浓度递增呈现较好的线性关系，具体表现为：沸煮10 min的线性是Y=0.003 1X-0.003 5，R2=0.989 1；沸煮15 min的线性是Y=0.003X-0.071，R2=0.994；沸煮30 min的线性是Y=0.003X+0.002，R2=0.992。

2.2 方法的准确性考察

进一步对方法的准确性进行了标准溶液添加测定回收率试验。选择本底茶样提取液游离氨基酸总浓度为32.8 mg/L的茶样添加50、100、200 mg/L的谷氨酸标准溶液浓度，按上述方法测定的回收率，结果如表2所示。可以看出，不同浓度的添加量，其回收率在70%～82%之间。

2.3 方法的精密度考察

称取0.1 g的干绿茶和抹茶分别加入25 mL去离子水沸煮30 min，自然冷却后用去离子水定至25 mL，离心取上清液，测定结果如表3所示。可以看出，抹茶和绿茶的标准偏差分别为6.3 mg/L和3.3 mg/L；变异系数分别为4.2%和5.3%，2组间测定结果差异不明显，说明方法稳定性较好。

3 结论

茶游离氨基酸总量法测定所采用的显色试剂为茚三酮，鉴于反应中间产物在碱性条件下不稳定[9]，国标（GB/T 8314—2002、GB/T 8314—2013）规定，在用水配制该试剂过程中需加入氯化亚锡作为抗氧化稳定剂，耗时较长，试剂需要提前1 d配制，且茚三酮在水中的溶解度较差，从而使显色体系操作步骤过于烦琐。本文在酸性缓冲体系（pH值5.6）中，对试剂配制作了简化处理，并摸索了适合氨基酸显色反应的条件，即将200 μL的2×pH 5.6的缓冲液、200 μL水或茶叶水提取液（茶水比1∶250，沸煮30 min）和400 μL茚三酮溶液显色体系均匀混合，并在一定时间沸煮结束后立即用自来水充分冷却并加入去离子水充分混合测定，所获得的结果稳定可靠，适宜作为茶叶中游离氨基酸总量的测定条件。

4 参考文献

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