一株产紫杉醇的红豆杉内生真菌的分离鉴定

张红涛，邓百万,2，陈文强,2，刘开辉,2，丁小维,2，顾东升，李华

(1.陕西理工学院 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000； 2.陕西省食药用菌工程技术研究中心， 陕西 汉中 723000; 3.勉县第一中学， 陕西 勉县 724200)

0 引 言

内生菌是指生活在植物体内的某一阶段，不引起植物组织明显病害的微生物[1]。内生菌包括内生细菌、内生放线菌和内生真菌。内生菌的特殊生境决定了其次级代谢产物的独特性。近几年来，有关内生菌的研究主要集中于药用植物，大量研究表明，内生菌能够产生与宿主相同或相近的活性物质。例如从桃耳七内生菌中分离得到鬼臼类化合物[2]，从红豆杉内生菌检测到巴卡亭Ⅲ[3]，Rangarajulu S K等[4]从银杏中分离得到产紫杉醇类物质的内生真菌。这些都表明利用内生真菌产生活性物质有着十分广阔的前景。

紫杉醇(Paclitaxel)是三环二萜类生物碱[5]，具有广谱抗癌性，对胸腺癌有着较好的疗效。自Stierle等[6]首次从红豆杉中分离出产紫杉醇的内生真菌紫杉霉(TaxomycesAndreanae)后，使得用微生物发酵法生产紫杉醇成为一种新的解决紫杉醇缺乏的途径。由于紫杉醇对乳腺癌、肺癌等具有较好的控制和治疗功效[7-8]，在医疗领域的需求量不断增加，目前已经出现了资源短缺。近年来，微生物发酵生产紫杉醇被认为是解决紫杉醇生产原料危机的良好方法。但由于单位发酵液产生的紫杉醇量很低，还没有一株产紫杉醇内生真菌用于工业化生产。从红豆杉中寻找产紫杉醇的内生真菌，无疑能为解决紫杉醇生产原料危机提供新的途径。

秦巴山区微生物资源丰富，有利于人们寻找新的产紫杉醇内生菌资源。本文从中国红豆杉中再次分离产紫杉醇的内生真菌，并对其进行菌种鉴定和代谢产物检测，以便获得新的产紫杉醇的内生真菌菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 红豆杉

中国红豆杉(Taxuschinensis)采自于陕西省佛坪县三官庙乡山林地，经陕西理工学院生物科学与工程学院杨培君教授鉴定。

1.1.2 培养基

综合马铃薯培养基：马铃薯200.0 g，KH2PO45.0 g，MgSO4·7H2O 3.0 g，维生素B10.01g，琼脂12.0 g，H2O 1 000 mL，pH自然。

查氏培养基：蔗糖30.0 g，NaNO32.0 g，K2HPO41.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO40.01 g，琼脂12.0 g，H2O 1 000 mL，pH自然。

1.1.3 主要仪器

高级显微镜(Nikon Eclipse Ti-S，尼康公司)、PCR仪(BIO-RAD，美国BIO-RAD公司)、凝胶电泳仪(TANON EPS300，上海天能科技有限公司)、旋转蒸发仪(IKA RV10，上海雅荣生化设备仪器有限公司)、高效液相色谱仪(Agilent 1200，美国Agilent公司)、质谱仪(Agilent 1100LC/MSD，美国Agilent公司)。

1.2 方 法

1.2.1 内生真菌分离与纯化

先将采集来的新鲜枝条置于自来水下冲洗4 h，将剥开的树皮在超净工作台中先用体积分数70%的酒精消毒30 s，无菌水冲洗4次，再用体积分数0.1% 的HgCl2消毒7 min后用无菌水清洗4次，将最后一次的洗液涂布于CPDA固体培养基上，作为对照组以检验是否消毒彻底。将处理好的材料用无菌研钵研磨至浆状，并涂布于CPDA上。把涂布好的培养皿置于28 ℃恒温培养箱中培养。当观察对照组的平板无菌长出，而实验组平板上长出菌丝后，及时将实验组平板上的菌块挑到新的CPDA培养基，重复多次即可纯化。

1.2.2 形态学鉴定

用插片法将纯化的菌株接于查氏培养基上，置于28 ℃培养箱下培养。待菌丝着生在盖玻片上时，将玻片取出，用棉兰染色，进行显微镜观察并初步分类。

1.2.3 分子生物学鉴定

挑取适量菌移入Ep管中，加入CTAB提取缓冲液800 μL，混匀置于65 ℃水浴，每5 min轻轻震荡几次，30 min后12 000 rpm离心15 min，吸取上清液，加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇溶液(25∶24∶1)混合振荡20 min，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，取上清液，加取上清液一半体积的异丙醇，-20 ℃冷冻30 min，12 000 r/min离心10 min，弃去上清液，用体积分数70%的乙醇洗涤沉淀2次，待晾干后溶于40 μL TE缓冲液中，于-20 ℃保存备用。

18S rDNA序列扩增：使用真菌18S rDNA通用引物序列：NS1(5’-GTAGTCATATGCTT GTCTC-3’)，NS6(5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’)。用CTAB法获得的真菌基因组作为模板，以18S rDNA通用引物进行PCR扩增。25 μL反应体系：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，模板1.0 μL，引物P1、P2各1.0 μL，Taq酶0.5 μL，加去离子水至25 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，36个循环，72 ℃延伸10 min。将PCR反应产物经凝胶电泳检测，并把胶回收。纯化后送由上海生工进行测序，把所得序列经BLAST比对分析，下载高相似度的序列，利用Mega 5.1软件构建系统发育进化树[9]。

1.2.4 发酵产物提取及检测

将其中Tax-4菌株接种至CPDA培养基上，28 ℃，160 r/min振荡培养箱培养7 d。用等体积乙酸乙酯萃取3次，在旋转蒸发仪上低压旋蒸至干燥。用少量甲醇溶解干燥物并定容至10 mL。

标准品配制：精确称取紫杉醇标准品1.0 mg，用10 mL甲醇溶解，配成100 mg/L母液备用。并逐步稀释到0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL的系列标准品溶液。

HPLC色谱条件：流动相为甲醇∶水=35∶65(V∶V)，流速1 μL/min，进样量20 μL，检测波长228 nm，柱温30 ℃，色谱柱C18(4.6 mm×150 mm)。

回归方程：y=6.087 8+3 589.391 3x(r=0.999 2)。

HPLC-MS检测条件：流动相同上，碰撞电压2 200 V，流速2 μL/min。

2 结果与分析

2.1 组织表面消毒检验

在28 ℃恒温条件下培养，对照组无其它菌长出，而实验组长出真菌，证明材料表面消毒彻底，实验组长出的是红豆杉的内生真菌，而不是组织材料的表面附生菌。

2.2 内生真菌的分离及菌株Tax-4的形态学特征

(a)正面 (b)反面图1 Tax-4菌落特征

图2 菌株Tax-4的形态学特征

从秦巴山区红豆杉鲜嫩树皮中分离到45株真菌，其中Tax-4菌株在CPDA培养基上的生长速度较慢。28 ℃培养7 d后观察菌落形态和菌丝显微观察，结果见图1和图2。

图1结果显示，菌落正面灰黑色，菌丝发达，中间显灰黑色，质地疏松，背面培养基中心显黄色。图2结果显示：菌丝有隔，较粗壮，产孢结构呈球形。孢子表面光滑，呈现灰黑色。依据形态特征，结合文献[10]可初步确定为黑团壳属(Massaria)。

2.3 Tax-4的系统发育树分析

利用18S rDNA通用引物(NS1和NS6)对内生真菌Tax-4进行序列扩增，获得一个880 bp左右的单一DNA条带，并对纯化的DNA条带进行测序分析并建立系统进化树，如图3所示。图3结果显示，内生真菌Tax-4(登录号：KF193057)同黑团壳属聚于同一分支，步长值为100。内生真菌Tax-4同已有的序列的同源性高达99%以上。结合形态学特征，该菌株可鉴定为黑团壳属(Massaria，Tax-4)。

图3 菌株Tax-4的18S rDNA系统发育树

2.4 Tax-4的发酵产物检测结果

利用高效液相对Tax-4菌株发酵液和紫杉醇标准品进行检测，发酵液中有紫杉醇，检测结果见图4。图4(a)结果显示，样品在12.559 min出现较强的吸收峰；图4(b)结果显示，标准品在保留时间为12.565 min时出现较强的吸收峰。同样条件下，可以初步判定样品与标准品二者属于同一种物质。

(a)样品 (b)标准品图4 菌株Tax-4产紫杉醇的HPLC检测

液质联用分析：如图5(a)，标准品产生m/z为864.2的M+H的离子峰和m/z为876.2的M+Na+的离子峰；如图5(b)，样品产生m/z为852.3的离子峰和m/z为875.8的M+Na+的离子峰。由此，样品和标准品的质谱特征离子峰大致一样，可说明Tax-4发酵液中含有紫杉醇。

(a)标准品检测结果 (b)样品检测结果图5 菌株Tax-4产紫杉醇的HPLC-MS检测结果

3 讨 论

从红豆杉中分离出一种内生真菌，结合形态学和18S rDNA等分子生物学手段将其鉴定为黑团壳属。通过对该菌株发酵液进行HPLC及HPLC-MS检测，发现该菌能够产生紫杉醇。经笔者统计，目前发现产紫杉醇真菌的大概有曲霉属、瘤座菌属、根霉属、镰刀菌属、肉座菌属、链格孢属等20多个属。有关黑团壳属产紫杉醇类物质尚属首次报道，无疑为发现产紫杉醇内生真菌的菌株提供了新的途径。

产紫杉醇内生真菌的发现是紫杉醇资源研究所取得的重要成就,由于内生真菌发酵生产紫杉醇技术成熟[11]，而且内生真菌生长迅速、周期短，目前已成为解决紫杉醇药物紧缺的有效途径[12-13]。因此，寻找更多产紫杉醇内生真菌的资源有待进一步研究。

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