添加乙酸对西藏燕麦和紫花苜蓿混合青贮发酵品质和有氧稳定性的影响

李君风，孙肖慧，原现军，郭刚，4，肖慎华，巴桑，余成群，邵涛＊

（1.南京农业大学动物科学技术学院 饲草调制加工与贮藏研究所，江苏 南京210095；2.中国科学院地理科学与资源研究所，北京100101；3.西藏日喀则地区草原工作站，西藏 日喀则857000；4.山西农业大学动物科学技术学院，山西 太谷030801）

西藏地处青藏高原西南部，素以“世界屋脊”著称，由于海拔高度不同，农区和牧区明显分离［1］。藏北牧区冬寒期长达7个月，天然草地生长期短暂，生产力水平低，难以为草食动物提供充足的饲草；畜牧业生产上存在“冬瘦、春死、夏肥、秋壮”的恶性循环［2－3］，而农区海拔较低，有较多的降雨量和较高的温度，牧草产量相对较高，所以在农区开展优质牧草种植，调制优质青贮饲料供牧区冬春季节草食动物利用，是解决藏北牧区冬春季节饲草料短缺的有效途径。由于西藏地区交通运输不便，青贮饲料开窖并分发到养殖户，需要较长时间，加之养殖户不懂得科学管理，剩余的青贮饲料散堆散放，易造成发霉变质，饲喂霉变的青贮饲料会影响家畜健康和畜产品品质，因此在西藏地区研究青贮饲料的发酵品质及有氧稳定性显得尤为重要。

乙酸是发酵抑制剂，同时可以参与动物的能量代谢，也是反刍动物合成脂肪的主要前体物质，能有效地提高乳脂率，对动物无毒害作用。Schmidt和Kung［4］研究表明，添加乙酸后能有效地降低pH，抑制青贮饲料中好氧性微生物的活性，防止青贮饲料的腐败变质。因此，将外源性的乙酸作为添加剂，能有效地提高青贮饲料的发酵品质及有氧稳定性。

燕麦（Avenasativa）和紫花苜蓿（Medicagosativa）是西藏主要栽培牧草，燕麦水溶性碳水化合物含量高，粗蛋白含量低，单独青贮易于成功［5］。紫花苜蓿富含蛋白质、矿物质和维生素，是目前国内外广泛栽培的豆科牧草之一，应用前景广阔，但由于其含糖量低、缓冲能高，不能保证青贮过程中乳酸发酵占优势地位，因此单独青贮较难成功。将两种牧草混合青贮，既能解决紫花苜蓿单独青贮难以成功的问题，又可以有效调控青贮原料的乳酸菌发酵底物和青贮饲料的蛋白质水平，改善青贮饲料发酵品质的同时也提高了青贮饲料的营养价值和适口性。王奇等［6］关于西藏苇状羊茅（Festucaarundinacea）和箭筈豌豆（Viciasativa）混贮的研究结果也表明了豆科牧草和禾本科牧草混合青贮能改善青贮饲料的发酵品质和营养价值。本试验根据燕麦和紫花苜蓿混合青贮比例筛选研究结果的基础上，探讨添加不同水平的乙酸对混合青贮发酵品质和有氧稳定性的影响，以指导西藏地区优质青贮饲料的生产和利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在西藏山南地区贡嘎县岗堆镇吉纳村试验地开展，该地区位于西藏自治区南部，处于雅鲁藏布江中游河谷区和江南高山宽谷区。地势西高东低，平均海拔3750m。属高原带干旱季风气候区，日照射时间长，气温日差较大，年差较小，冬春寒冷多风，雨季降水集中，形成长冬无夏，春秋相边的气候特点。年降水量为356.6mm，集中在6－9月份。牧草和粮食作物均在该季节收获。

试验将种植于西藏山南地区贡嘎县岗堆镇吉纳村试验地的燕麦和紫花苜蓿于2012年9月15日刈割，刈割后在田间用铡刀切成2cm左右，将70%燕麦和30%紫花苜蓿充分混匀，作为青贮材料。燕麦为乳熟期，紫花苜蓿处于第2茬初花期。各青贮材料化学成分见表1，微生物组成见表2。

表1 青贮前燕麦和紫花苜蓿主要化学成分Table 1 Chemical composition of fresh oat and alfalfa before ensiling

表2 青贮前燕麦和紫花苜蓿微生物组成Table 2 Microbial composition of fresh oat and alfalfa before ensiling

1.2 试验设计

试验采用完全随机设计，设对照组和3个不同添加剂处理组：①对照组（CA，无添加）；②0.3%乙酸添加组（0.3A）；③0.4%乙酸添加组（0.4A）；④0.5%乙酸添加组（0.5A），在青贮后第30，45，60天分别打开青贮窖，取样分析发酵品质；剩余实验室青贮窖在青贮60d后打开，用镊子掏松，使空气充分渗入，在随后的第5，10，15天取样分析有氧暴露过程中各项指标的变化。每个处理各个时间点各5个重复，共计120个实验室青贮窖。

1.3 试验方法

1.3.1 青贮饲料的调制 将燕麦和紫花苜蓿分别刈割，用铡刀切成2cm左右，按试验设计比例（7∶3）称取混匀，加入添加剂，充分混匀后装填至2L的实验室青贮窖中，压实盖上内外盖，并用胶带密封，置于室温条件下保存。

1.3.2 样品处理 在青贮第30，45和60天分别打开实验室青贮窖取出全部青贮饲料，将其混合均匀称取35g放入100mL的广口三角瓶，加入70g去离子水，4℃浸提24h，然后通过2层纱布和定性滤纸过滤，所得液体为青贮饲料浸提液，置于－20℃冷冻冰箱保存待测。滤液用来测定pH值、乳酸（lactic acid，LA）、氨态氮（ammonia nitrogen，AN）和挥发性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs），将剩余部分青贮饲料收集烘干，测定干物质（dry matter，DM）、总氮（total nitrogen，TN）以及水溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates，WSC）。

1.3.3 测定项目及分析方法 原料草和青贮饲料在65℃烘箱中干燥60h至恒定重量，测定干物质含量（dry matter，DM）；缓冲能（buffer capacity，BC）测定用盐酸－氢氧化钠滴定法；pH值用pH211型精密pH计（HANNA公司）测定；乳酸含量（lactic acid，LA）用对－羟基联苯比色法测定；水溶性碳水化合物用蒽酮硫酸比色法测定；氨态氮采用苯酚－次氯酸钠比色法测定；总氮用KjeltecTM2300型全自动凯氏定氮仪测定；乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸用GC－14B型气相色谱仪（日本岛津公司），色谱条件：柱温125℃，汽化室温度180℃，检测器温度220℃，检测器FID，载气为氮气，压力为0.05MPa，氢气压力为0.05MPa，空气压力为0.05MPa［7］。乳酸菌、好氧性细菌、酵母菌和霉菌数量采用平板计数法，分别选用MRS（deMan－Rogosa－Sharpe）琼脂培养基、营养琼脂培养基（nutrient agar）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar），35℃恒温培养2～3d，对菌落数进行计数［8］。

1.4 数据处理

采用SAS（8.2）软件对试验数据进行单因子方差分析（One－Way ANOVA），并用邓肯氏（Duncan）方法对处理间及青贮天数间平均数进行多重比较（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 青贮原料燕麦和紫花苜蓿化学与微生物成分分析

青贮原料燕麦干物质、水溶性碳水化合物、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量均高于紫花苜蓿（P＜0.05）；而紫花苜蓿的粗蛋白含量、缓冲能较燕麦高（P＜0.05）（表1）。紫花苜蓿的好氧性细菌数量高于燕麦（P＜0.05），其他微生物的数量两种材料间差异不显著（P＞0.05）（表2）。

2.2 添加乙酸对燕麦和紫花苜蓿混合青贮过程中干物质、pH和乳酸含量的影响

整个青贮过程中，各组干物质含量变化不显著（P＞0.05）（表3）。各组pH值变化不大，但随着乙酸添加量的增加，pH值呈下降趋势，且各处理组pH值均显著（P＜0.05）低于对照组，0.4%与0.5%乙酸处理组显著低于0.3%乙酸处理组（P＜0.05）。随着青贮时间的延长，乳酸含量总体呈上升趋势，各处理组乳酸含量均显著高于对照组（P＜0.05），在青贮第45天，0.4%乙酸添加组乳酸含量显著高于其他组（P＜0.05），发酵60d后处理组仍显著高于对照组（P＜0.05），但处理组间差异不显著（P＞0.05）。

表3 添加乙酸制剂对混合青贮过程中pH、干物质和乳酸含量的影响Table 3 Effect of adding acetic acid on pH，DM and LA contents of mixed silages during ensiling

2.3 添加乙酸对燕麦和紫花苜蓿混合青贮过程中挥发性脂肪酸含量的影响

随着青贮时间的延长，各组乙酸含量呈升高趋势（表4），处理组乙酸含量高于对照组（P＜0.05），并随着乙酸添加量的增加，青贮饲料中乙酸含量明显提高（P＜0.05），但到青贮第60天，各处理组间乙酸含量差异不显著（P＞0.05）。整个青贮过程，丙酸、丁酸含量各组间差异不显著（P＞0.05），总挥发性脂肪酸变化趋势与乙酸一致。

表4 添加乙酸制剂对混合青贮过程中挥发性脂肪酸含量的影响Table 4 Effect of adding acetic acid on volatile fatty acid contents of mixed silages during ensiling

2.4 添加乙酸对燕麦和紫花苜蓿混合青贮氨态氮/总氮、乳酸/乙酸和水溶性碳水化合物含量的影响

在整个青贮过程中乳酸/乙酸虽有波动（表5），但整体变化不显著（P＞0.05），添加0.4%乙酸处理组乳酸/乙酸最高。各组氨态氮/总氮呈逐渐上升的趋势，在青贮第60天，各处理组均低于对照组（P＜0.05），并且随着乙酸添加量的增加氨态氮/总氮有降低趋势。随着青贮时间的延长，各组水溶性碳水化合物均呈下降趋势，并随着乙酸添加量的增加有提高趋势，各处理组高于对照组（P＜0.05），其中0.4%乙酸处理组显示最高的水溶性碳水化合物。

2.5 添加乙酸对开窖后有氧暴露过程中pH值、氨态氮/总氮、乳酸和水溶性碳水化合物含量的影响

在有氧暴露的前10d，pH基本保持稳定（图1），之后到有氧暴露15d，pH值呈升高趋势，其中各处理组pH值均低于对照组（P＜0.05），而各处理组间差异不显著（P＞0.05）。在整个有氧暴露阶段乳酸含量整体呈下降趋势，各处理组均高于对照组（P＜0.05），其中0.4A处理组乳酸含量保持最高。整个有氧暴露阶段各组水溶性碳水化合物含量均有不同程度下降，其中对照组10d后显著下降，0.4%和0.5%乙酸添加组水溶性碳水化合物含量始终高于对照组（P＜0.05）。整个有氧暴露阶段氨态氮/总氮值总体变化不大，在有氧暴露5和10d，处理组低于对照组（P＜0.05），而处理组间差异不显著（P＞0.05），至有氧暴露15d，0.5%乙酸处理组的氨态氮/总氮最低，并显著（P＜0.05）低于其他组。

表5 添加乙酸制剂对混合青贮过程中氨态氮/总氮、乳酸/乙酸和水溶性碳水化合物含量的影响Table 5 Effect of adding acetic acid on the value of ammonia nitrogen/total nitrogen and lactic acid/acetic acid，and the content of water soluble carbohydrates of mixed silages during ensiling

图1 有氧暴露过程中不同乙酸添加组pH值、氨态氮/总氮、乳酸和水溶性碳水化合物含量变化Fig.1 Changes of contents of lactic acid and water soluble carbohydrate，pH value and ammonia/total nitrogen of mixed silages adding with acetic acid treatments during aerobic exposure

3 讨论

3.1 添加不同水平乙酸对全株燕麦和紫花苜蓿混合青贮发酵品质的影响

有机酸及其盐类可迅速降低青贮初期的pH值，抑制植物酶和微生物活性，已被作为青贮发酵抑制剂广泛应用于青贮饲料生产中［9－10］，其中乙酸作为常用的消毒防腐剂，能抑制霉菌、酵母等有害微生物的生长和繁殖，减少对发酵底物的消耗，为乳酸菌的生长繁殖提供良好条件。

本试验将乙酸添加到全株燕麦和紫花苜蓿混合青贮中，结果显示青贮30d各组pH值均已降至4.0以下，且之后均维持在稳定状态，其中乙酸添加组的pH较低，乳酸和水溶性碳水化合物含量较高，这可能是由于添加乙酸抑制了早期好氧性微生物的活性，减少了好氧性微生物与乳酸菌对水溶性碳水化合物的竞争，为乳酸菌节省了底物，产生了更多的乳酸，在青贮结束时有较多的水溶性碳水化合物残留，进而提高了水溶性碳水化合物的利用效率［11］。Moon［12］研究显示浓度大于100mmol/L的乙酸盐即可有效抑制酵母等微生物的生长。张新慧等［13］研究了2种乙酸盐（双乙酸钠和脱氢乙酸钠）对玉米（Zeamays）青贮的影响，结果显示将脱氢乙酸钠加入玉米青贮中抑制了细菌及真菌的活动，较大程度地保留了饲料中水溶性碳水化合物和营养物质。许庆方等［14］研究发现添加0.2%乙酸显著降低了玉米青贮饲料的pH值，对玉米青贮饲料发酵品质的改善效果优于绿汁发酵液。而本研究中0.3%乙酸添加组pH值低于对照，但高于0.4%和0.5%乙酸添加组，且乳酸含量也低于这二者，而0.5%添加组各时间点乳酸含量均低于0.4%添加组，这可能是由于乙酸添加量不同造成而引起的，表明全株燕麦和紫花苜蓿混合青贮时添加0.3%的乙酸对有害微生物的抑制效果不及0.4%，而添加0.5%乙酸不仅抑制了有害微生物活性，也对乳酸菌活性造成了一定的影响。

Henderson［15］曾报道指出发酵品质良好的青贮饲料氨态氮/总氮应小于80g/kg TN，氨态氮主要由青贮过程中蛋白质和氨基酸降解产生，直接影响青贮饲料的营养价值，是评定青贮饲料优劣的重要指标之一。本试验青贮60d后对照组略高于此值，而乙酸添加组均低于此值，这与乙酸对微生物的抑制效果有关。有机酸常作为发酵抑制剂应用到青贮饲料生产中，其中Shao等［16］将0.1%山梨酸添加到黑麦草（Loliumperenne）青贮中，发现山梨酸可有效提高青贮发酵品质，高效地抑制了梭菌和其他好氧性微生物的生长。张增欣和邵涛［17］在多花黑麦草（Loliummultiflorum）青贮时添加0.25%丙酸，显著降低了氨态氮含量，更好地保存青贮饲料的营养价值。

3.2 添加不同水平乙酸对全株燕麦和紫花苜蓿混合青贮饲料有氧稳定性的影响

Wilkinson和Davies［18］指出未解离短链脂肪酸以被动运输的形式进入微生物细胞内部，之后释放H＋降低内部pH值，从而杀死细胞，抑制真菌等微生物的生长繁殖，而乙酸和丙酸的解离程度低于乳酸，可以有效抑制青贮饲料有氧暴露阶段酵母、霉菌和真菌的生长繁殖，因此乙酸和丙酸含量已成为预测青贮有氧稳定性优劣的主要指标之一。青贮窖打开后，厌氧环境被破坏，好氧性微生物开始活跃，对照组pH随着有氧暴露时间的延长显著上升，而乙酸添加组间基本保持稳定无显著变化，各组乳酸和水溶性碳水化合物含量均随着暴露时间的延长而降低，其中对照组的乳酸和水溶性碳水化合物含量最低，氨态氮/总氮最高，这是由于好氧性微生物对乳酸、水溶性碳水化合物、蛋白质和氨基酸的降解引起，而乙酸可以抑制有氧阶段好氧性微生物对营养成分的降解，从而达到保存青贮饲料养分和提高有氧稳定性的目的［19］。Danner［20］研究了乳酸、1，2－丙二醇和乙酸等对全株玉米青贮有氧稳定性的影响，证实乙酸能够有效抑制好氧性微生物的生长，提高青贮饲料有氧稳定性。

4 结论

从pH、氨态氮、乳酸及水溶性碳水化合物含量等指标的动态变化来看，添加乙酸可以改善燕麦和紫花苜蓿混合青贮发酵品质和有氧稳定性。添加0.4%乙酸对好氧性微生物的抑制效果优于0.3%乙酸添加组，而添加0.5%乙酸尽管抑制了好氧性微生物活性，但对乳酸菌活性也造成了一定的影响。综上所述，依据研究结果和西藏地区生产实际，将燕麦和紫花苜蓿以7∶3混合青贮，以添加0.4%的乙酸最适宜。

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