Th17细胞、调节性T细胞、Th1细胞平衡失调与AS病情活动度的关系

张海龙,张俊英,晋学英,牛敬宪,黎珍娟,张凤兰

(涉县中医院 1外科， 2针灸推拿科， 3妇产科， 4内科， 5皮肤科， 6检验科, 河北 涉县 056400)

免疫调控平衡对维持机体正常生命活动及预防自身免疫疾病具有重要的意义。调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)是一类控制体内自身免疫反应性的细胞群，具有减轻机体炎症损伤，控制免疫应答效应的作用[1]。Th17是近年发现可分泌白细胞介素(interleukin,IL)17辅助T细胞，而IL-17可诱导机体组织损伤及引发炎性反应[2]。目前已有发现多种自身免疫疾病的发生与Th17细胞调节失衡有关。Th1辅助细胞具有抵抗机体免疫反应的作用，其主要为IL-12诱导产生[3]。强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种累及脊柱及骶髂关节的系统性、慢性炎症疾病[4]。目前不少研究表明免疫细胞调控失衡与AS发病及病情进展具有密切的关系[5]。本研究将通过测定Th1、Th17、Treg细胞比率及其相关炎症因子水平，探讨AS患者外周血Th1/Th17/Treg细胞失衡情况及其与强直性脊柱炎疾病活动评分(ankylosing spondylitis disease activity score,ASDAS)的关系，旨在为AS临床防治提供指导。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2012年1月至2014年1月涉县中医院风湿骨病科收治的60例AS患者(AS组)为研究对象。其中男48例、女12例，年龄18～62(39.0±3.2)岁，病程1～12(4.8±1.2)年。参照国际强直性脊柱炎协会(ASAS)2009年制订的ASDAS诊断标准[7]将AS患者分为病情稳定(ASDAS<1.3)14例，病情中度活动(1.3≤ASDAS<2.1)28例，重度(ASDAS≥2.1)18例。另选取同期在本院行正常体检者60例为对照组，男48例、女12例，年龄20～62(39.2±3.1)岁，均不符合AS诊断标准，其余排除标准与AS组相同。两组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2纳入标准 ①均符合1984年修订AS纽约标准[6]；②所有受试者均签署知情同意书。排除标准：①肝肾功能不全、血液系统疾病、内分泌疾病、多发性硬化疾病者；②近3个月内应用过激素或免疫抑制剂者；③查体时发现心肺、内分泌系统感染者；④活动性肺结核、恶性肿瘤、炎性肠病者。

1.3方法

1.3.1血液样本制备 AS组与对照组于清晨8:00～9:00点空腹抽取静脉血5 mL，加入肝素钠抗凝，置于离心机中以离心半径15 cm, 3000 r/min离心10 min后，弃去上清液，并置于-80 ℃中待测。

1.3.2Th1、Th17、Treg细胞比率的测定 取上述样品于常温下复温后，加入淋巴细胞分离液(北京宝来生物科技公司)，应用密度梯度离心法分离外周血单核细胞，采用RPM1640将细胞浓度调整为2×106mL-1，将细胞接种于6孔培养板中培养，收集对数生长期的细胞于测定管中，分别加入鼠抗人CD8单抗(美国Sigma公司)及鼠抗人CD3单抗(美国Sigma公司)，与4 ℃避光反应20 min，采用固定液于室温下固定15 min后离心处理10 min弃去上清液，磷酸盐缓冲液洗涤2次后，分别加入IL-17A-FTTC(澳大利亚eBioscience公司)及IFN-γ-FTTC(澳大利亚eBioscience公司)进行细胞质染色。染色后采用美国贝克曼公司提供的Beckm Epics流式细胞仪测定外周血CD4+Th17、CD4+Th1及CD4+CD25+Treg细胞比率。

1.3.3炎性因子水平测定 采用酶联免疫法测定两组血清IL-6、IL-8、IL-17、IL-23及TNF-α水平，各血清细胞因子试剂盒均由北京中杉金桥生物有限公司提供，操作方法严格按照试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1两组外周血CD4+Th17、CD4+Th1及CD4+CD25+Treg细胞比率 AS组患者CD4+Th17细胞水平高于对照组，而CD4+Th1及CD4+CD25+Treg细胞水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 两组外周血CD4+ Th17、CD4+ Th1及 CD4+CD25+ Treg细胞比率 %)

AS组：强直性脊柱炎；对照组：正常体检者

2.2两组炎性因子水平分析 AS组IL-6、 IL-17、IL-23及TNF-α蛋白水平显著高于对照组(P<0.05)(表2)。

表2 两组炎性因子水平分析

组别例数IL-6IL-8IL-17IL-23TNF-αAS组6011.36±1.635.58±1.2637.58±5.12514.23±42.1238.12±4.62对照组603.75±1.215.96±2.368.96±0.89186.32±34.567.89±2.45t5.1690.4859.15812.9638.125P0.0000.1100.0000.0000.000

AS组：强直性脊柱炎；对照组：正常体检者

2.3不同ASDAS患者外周血CD4+Th17、CD4+Th1及CD4+CD25+Treg细胞比率 与病情稳定、中度活动患者相比，重度患者CD4+Th17细胞水平显著升高，而CD4+Th1、CD4+CD25+Treg细胞显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表3 两组外周血CD4+ Th17、CD4+ Th1及 CD4+CD25+Treg细胞比率 %)

a：与稳定相比，P<0.05；b：与中度活动相比，P<0.05

2.4不同ASDAS患者炎性因子水平分析 与病情稳定、中度活动的患者相比，重度患者的IL-6、 IL-17、 IL-23及TNF-α蛋白水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)(表4)。

表4 不同ASDAS患者炎性因子水平分析

病情例数IL-6IL-8IL-17IL-23TNF-α稳定 145.36±1.488.12±2.1414.85±1.12242.36±51.4811.28±3.14中度活动289.68±2.52a8.39±2.2825.98±3.48a386.12±95.23a30.98±4.98a重度 1814.26±3.89ab8.37±2.98 42.69±4.63ab598.36±101.45ab43.12±5.13abF8.7960.44214.26925.6929.526P0.0000.1250.0000.0000.000

a：与稳定相比，P<0.05；b：与中度活动相比，P<0.05

2.5炎性因子水平与ASDAS的关系 经Pearson相关分析可知，ASDAS与IL-6(r=0.412，P=0.000)、IL-17(r=0.396，P=0.000)、IL-23(r=0.384，P=0.000)及TNF-α(r=0.318，P=0.004)呈正相关，而与IL-8无相关(r=-0.146，P=0.128)。

3 讨 论

研究表明AS的发生与T细胞亚群比例失调具有密切的关系，其发病过程与T细胞亚群功能异常及其下游Th17/IL-23被激活和未折叠的蛋白免疫应答反应增强有关[8]。CD4+T是机体免疫应答反应中的主要部位，根据CD4+T细胞分化功能性可分为Th1、Th2、Th17、Treg等亚群，在正常情况下这些Th细胞亚群彼此间相互联系、相互牵制，处于动态平衡，但当机体发生感染、慢性炎症损伤或遗传异常时，这些T细胞亚群彼此间的平衡将被打破，从而导致机体免疫调控失衡，引起自身免疫性疾病。

Treg是一类控制体内自身免疫反应性的细胞群,其具有抑制T细胞增殖及调节机体免疫力的作用[9]。Zhao等[10]通过体外动物实验发现，Treg细胞可通过抑制Th17细胞分化或下调IL-17, IL-23表达来抑制Th17细胞增生。Xueyi等[11]对应用Th17受体拮抗剂治疗的小鼠敲除或阻断Th17受体阻断后能有效抑制骨关节炎的发生，减少骨组织及关节组织损伤。本研究结果显示，AS组患者CD4+CD25+Treg细胞水平低于对照组，且随着ASDAS的增加，其水平显著下降(P<0.05)，而AS组患者CD4+Th17细胞水平显著高于对照组，

且随着ASDAS的增加，其水平显著升高。这提示在AS患者中外周血Treg水平受到抑制，而Th17细胞则处于活跃状态，Treg/Th17免疫格局偏向Th17，从而可以推测AS患者机体内免疫调控机制紊乱与Treg细胞数量减少导致Treg/Th17免疫格局失衡有关。

Th1细胞与Th17细胞均源于CD4+T细胞，初始CD4+T细胞在干扰素γ、IL-2等细胞因子的介导下可分化为Th1细胞，在IL-1、 IL-6、转化生长因子β介导下则可分化为Th17细胞[12]。Chen等[13]研究指出，Th1细胞与Th17细胞可相互拮抗，Th1在特异情况下可转化为Th17,而Th17在特殊情况下也可转化为Th1。本研究结果显示，AS组患者CD4+Th17的比率显著高于对照组，而CD4+Th1比率低于对照组，且随着ASDAS的增加，CD4+Th17水平显著升高，而CD4+Th1水平显著下降，从而表明AS患者体内存在Th17与Th1相互拮抗的现象，且CD4+Th1水平低下可介导细胞功能低下。

IL-6、 IL-17、 IL-23及TNFα是由Th17分泌的促炎因子，这些炎性因子可激活机体T细胞及其他相关免疫细胞大量生成细胞黏附因子、化学增活素及自由基等，从而进一步加剧机体炎性反应，引起机体炎症损伤[14]。本研究结果显示，AS组IL-6、IL-17、IL-23及TNFα蛋白水平显著高于对照组(P<0.05)，且随着ASDAS的增加，AS组IL-6、IL-17、IL-23及TNFα蛋白水平显著升高，与ASDAS呈正相关，从而表明AS的发生与免疫失调引起的促炎因子大量释放及抑制炎性因子分泌不足有关。

综上所述，AS患者中存在Th1细胞、Th17细胞及Treg细胞免疫平衡失调，且与AS患者ASDAS程度具有密切的关系。通过测定AS患者相关炎性因子水平对预测患者病情进展具有重要的意义。

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