甲状腺毒症大鼠心肌重构与碱性成纤维细胞生长因子的关系

王文锋

(商洛市中心医院心血管内科，陕西 商洛 726000)

甲状腺激素与人体的生长发育和代谢密切相关。各种原因导致甲状腺激素过多的释放入血，可对心血管系统造成损害。其基本机制是交感神经活性增强与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin angiotensin aldosterone system，RAAS)的启动[1-3]。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是人体正常组织器官中具有多种生物学功能的多肽生长因子，主要刺激多种间质来源和神经外胚层来源细胞的分化增殖和趋化，病理情况下也可由血管平滑肌细胞及粥样斑块中的坏死细胞产生,参与心肌缺血和梗死后的组织修复，在心血管疾病的病理生理过程中发挥重大的作用[4-5]。本研究通过测定甲状腺毒症大鼠心肌bFGF水平变化，探讨其在甲状腺毒症心血管损害中的作用。

1 材料与方法

1.1动物分组及模型制备 45只成年雄性SD大鼠(购自西安交通大学动物实验中心)，无特定病原体级别，体质量260～330 g，于室温(21±3) ℃、相对湿度(55±5)%条件下颗粒饲料喂养，自由饮水。适应性饲养2周后按完全随机法分为两组：对照组22只，给予生理盐水5 mL/kg灌胃；甲状腺毒症模型组23只，给予左旋甲状腺素钠0.5 mg/kg灌胃。对照组体质量(274±30) g，甲状腺毒症模型组体质量(278±20) g,两组间差异无统计学意义，具有可比性。每日灌胃1次，4周后用3%戊巴比妥钠按照10 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，经腹主动脉抽血5～6 mL，在4℃低温以1350×g，3000 r/min、离心10 min，汲取上层血清，-20 ℃保存备用。

1.2主要实验试剂和设备 左旋甲状腺素钠：Merk KgaA,Germany；放射免疫固相微球分离三碘甲状腺原氨酸总量(total tri-iodothyronine,TT3)、甲状腺素总量(total thyroxine,TT4)试剂盒：货号 IMK439/IMK440,北京原子股份有限公司生产；促甲状腺素(thyroid-stimulting hormone，TSH)免疫放射分析试剂盒：天津市协和科技有限公司生产；bFGF一抗：兔抗鼠-rat bFGF，北京博奥森生物技术有限公司生产；亲和纯化抗体(羊抗兔)，标记长臂生物素，效价1∶100～1∶200；GC400γ放射免疫计数器：合肥科大创新生产。

1.3血清TT3、TT4、TSH的测定 TT3、TT4放射免疫试剂盒(固相微球分离法)中自带空白对照管、标准管及样品管，空白对照管中加入125I-T3/125I-T4200 μL，标准管中依次加入浓度梯度标准液50 μL、125I-T3/125I-T4200 μL、T3/T4微球抗体 200 μL，样品管依次加入血清样品50 μL 、125I-T3/125I-T4200 μL、T3/T4微球抗体200 μL，经温育、低温离心后弃去上清，置于GC400γ放射免疫计数仪中测定沉淀放射性计数60 s，预设为四参数方程曲线拟合方式，依据各管放射性计数计算出放射性碘的结合率，所以测得的结合率与样品TT3或TT4的水平呈负相关，依据标准品浓度与结合率的关系按照四参数方程曲线拟合方式求得待测样品的浓度。

采用TSH免疫放射分析试剂盒(一步夹心法)测定大鼠TSH，用单抗固相包被管预设质控管、浓度梯度标准管及样品管。质控管及样品管中加入质控液或血清200 μL、125I-TSH单抗50 μL，各标准管中依次加入浓度梯度的TSH标准品200 μL、125I-TSH 单抗50 μL，经震荡、洗涤后倾倒液体并吸干剩余水分，按照与测定TT3和TT4相似的方法求得血清样品中TSH的浓度。

1.4心/体质量比测量 抽血后于大鼠左心室内注射1.34 mol/L氯化钾使心脏停搏，取出心脏，沿动静脉根部剪去残余血管，生理盐水冲洗干净后用清洁滤纸吸干水分，称量心脏湿重，计算心脏与体质量比，用心脏的毫克数与体质量的百克数计算结果作为比值。

1.5心肌细胞直径、胶原容积测定 剪取心脏左心室组织50～60 mg，置入10%甲醛固定24 h，经过渡、脱水、透明、浸蜡包埋后切片，常规苏木精-伊红染色及Masson染色。使用CMIS-B型细胞医学图像分析系统测量心肌细胞横切面跨核处最长直径，单位为“μm”。每个视野下随机测量10个细胞，每个标本随机移动5个区域测量，求平均值。采集Masson染色图像，分别测量胶原纤维面积及视野总面积，计算比值作为心肌胶原容积，胶原容积=每一视野胶原纤维面积/每一视野总面积，每个标本随机采集3个不同区域的图像，求其平均值[6-7]。

1.6心肌bFGF测定 心肌石蜡切片进行免疫组织化学染色，采用链霉亲和素-生物素-辣根过氧化物酶物法。经常规脱蜡水化、修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育，滴加链霉亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物，静置、洗涤、显色、复染后做脱水、透明处理，风裱剂封片。用CMIS-B型细胞医学图像分析系统400×镜下随机截取免疫组织化学切片图像，每标本随机选10个位点测量阳性反应产物面积，然后取平均值。应用图像处理系统测定阳性产物灰度表示阳性产物强度，灰度数值愈大(灰度层次愈小)则阳性反应物的反应强度愈小。背景灰度测量值-阳性物灰度测量值作为阳性强度灰度值，阳性反应面积/测量面积×阳性强度灰度值作为bFGF阳性指数。

2 结 果

2.1两组大鼠一般情况比较 灌胃1周后甲状腺毒症模型组大鼠容易激惹，进食及饮水显著增加，伴有明显的肌肉震颤、稀便及排便次数增加。4周后甲状腺毒症模型组大鼠脉率(414±25)次/min，较对照组(366±23)次/min升高(t=6.6，P<0.01)，收缩压(139±4) mmHg，较对照组(121±7) mmHg升高(t=10.2,P<0.01)，差异有统计学意义。

2.2两组大鼠血清TT3、TT4、TSH水平比较 甲状腺毒症模型组大鼠血清TT3、TT4水平较对照组显著升高；甲状腺毒症模型组大鼠血清TSH较对照组显著降低(表1)。

表1 两组大鼠血清TT3、TT4、TSH水平比较

组别只数TT3(mmol/L)TT4(mmol/L)TSH(mU/L)对照组 220.6±0.14.5±1.00.12±0.02甲状腺毒症模型组230.8±0.118.2±2.5 0.09±0.01t5.024.16.0P<0.01 <0.01 <0.01

TT3:三碘甲状腺原氨酸总量; TT4:甲状腺素总量; TSH:促甲状腺素

2.3心/体质量比、心肌细胞直径、心肌胶原容积及心肌bFGF阳性指数比较 甲状腺毒症模型组心/体质量比较对照组显著增加；心肌细胞直径、心肌细胞胶原容积及bFGF阳性指数较对照组显著增高，差异均有统计学意义(P<0.01)(表2)。

表2 两组心/体质量比、心肌细胞直径、胶原容积及bFGF阳性指数比较

组别只数心/体质量比心肌细胞直径(μm)心肌胶原容积(%)bFGF阳性指数对照组 22260±3211.7±1.53.0±1.15.6±1.1甲状腺毒症模型组23335±21 15.0±1.6 8.9±0.7 18.3±1.4 t9.127.120.533.4P<0.01 <0.01 <0.01 <0.01

bFGF: 碱性成纤维细胞生长因子

3 讨 论

心肌重构是心脏对体内外环境变化的适应性反应，包括功能重构(早期重构)和结构重构(晚期重构)，与各种神经内分泌机制激活有关，主要是交感系统与RAAS激活。甲状腺毒症引起的心肌重构与交感神经兴奋性增加的关系已毋庸置疑，主要涉及早期的功能重构，表现为快速性心律失常及外周循环的高动力状态，而在甲状腺毒症心肌损害的晚期结构改变及心力衰竭与心肌肥厚的发生和发展中可能与RAAS机制关系密切。

本实验给予甲状腺激素灌胃4周后，大鼠的心肌细胞直径及胶原容积显著增加，心肌细胞增粗，免疫组织化学见bFGF呈强阳性表达，对照组少有bFGF表达。这一结果说明甲状腺毒症大鼠心肌肥厚随着bFGF表达的增高而增加，而bFGF可能是甲状腺毒症心肌肥厚的机制之一。何作云等[6]研究表明，二尖瓣关闭不全伴狭窄的压力超负荷左心室肥大病，以及先天性心脏病(法洛氏四联征或三联征)患者容量超负荷的右心室肥大患者，其肥大心肌细胞中bFGF和转化生长因子的信使RNA表达及其蛋白水平均显著增加，证明bFGF可以在压力超负荷及容量超负荷时表达增加，参与心肌肥厚的形成。目前已经明确的bFGF表达增加的机制有：①外周血流量增加，血流加速，形成湍流，使血管壁内皮细胞受到的剪切力增加，一氧化氮的表达增加，诱导内生性bFGF；②心率加快、循环血量增多、压力负荷增加等血流动力学改变与心率依赖性的机械生长因子表达增加可以介导心肌bFGF表达增加；③压力超负荷及容量超负荷，引起RAAS机制激活，并上调心肌血管紧张素1受体的表达，诱导心肌细胞原癌基因C-myc信使RNA的过度表达，也可以增加bFGF的表达[9-11]。bFGF以自分泌及旁分泌方式，亦可通过胞内分泌的方式——核转位机制直接发挥其基因调控作用。bFGF可以促进血管平滑肌细胞分化增殖与尿激酶型纤溶酶原激活物的表达上调，促进心肌肥厚的发展[12-13]。

综上所述，甲状腺毒症心肌肥厚与bFGF的关系可以概括为交感激活，容量和(或)压力超负荷，RAAS启动，bFGF表达增加，促进心肌细胞肥大与胶原纤维增生，导致心肌肥厚。这一发现可以进一步明确甲状腺毒症交感及RAAS激活导致心肌肥厚的机制，为甲状腺毒症心肌损害研究提供新的思路，提示甲状腺毒症早期改善血流动力学的抗交感及抗RAAS治疗相当重要，如有可能，阻断bFGF亦可为甲状腺毒症乃至其他原因引起心肌重构的方法之一。

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