白细胞介素-33在慢性阻塞性肺疾病患者体内的表达及变化规律的研究

管淑红 周 军 徐乾乾*

（苏州大学附属第三医院，江苏 常州 213000）

白细胞介素-33在慢性阻塞性肺疾病患者体内的表达及变化规律的研究

管淑红 周 军 徐乾乾*

（苏州大学附属第三医院，江苏 常州 213000）

目的 研究白细胞介素-33（IL-33）在慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者体内的表达及其因病情不同转归而动态改变的规律。方法 31例COPD急性加重期（AECOPD）患者依据GOLD诊断分级标准分三组：轻度组，中度组和重-极重度组，实时荧光定量RT-PCR检测患者治疗前后外周血单个核细胞IL-33的基因表达。结果 健康人及轻度COPD患者IL-33基因表达维持在低水平，中度和重-极重度患者其表达明显增加，急性加重时升高尤为明显，治疗后病情缓解IL-33表达水平也随之下调。结论 COPD患者体内表达IL-33水平随病情严重程度而升高，病情恶化或好转时，IL-33表达水平都随之同步改变。

白细胞介素-33；慢性阻塞性肺病；实时荧光定量RT-PCR

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是以气流受限不完全可逆为特征的疾病。气道炎症尤其是小气道炎症是COPD的主要病变及发病的主要原因。COPD在全球范围内的发病率和病死率不断上升，至2007年，在我国农村COPD已成为第一位的死亡杀手[1]，目前是全球第四大死亡原因[2]。COPD越来越受到国内外医学专家的广泛关注和重视，目前普遍认为COPD是一种复杂的慢性气道炎症，众多细胞因子构成一个复杂的网络调控着疾病的发生、发展及转归，Th2型细胞因子优势是COPD发病机制之一[3]。白细胞介素-33（IL-33）是新近发现的Th2型细胞因子，已有研究证实IL-33与气道高反应密切相关[4]，本课题旨在研究IL-33在COPD患者体内的表达及其动态改变的规律。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象：参照中华医学会呼吸病学分会COPD学组的诊断标准及排除标准，选择2011年9月至2012年12月苏州大学附属第三医院呼吸内科AECOPD患者31例。纳入标准：①咳嗽、咳痰病史连续2年以上；②肺功能检查，吸入支气管舒张剂后，FEV1/FVC＜70%；③符合文献[5]COPD急性加重（AECOPD）的1型和2型标准，即气促加重、痰量增加和痰转脓性3项症状至少存在2项。排除合并有左心功能不全、心肌梗死、冠心病、房颤、慢性肝肾功能不全、肿瘤、急性肺栓塞、弥漫性间质性肺病、气胸或纵隔气肿、血管炎性疾病、结缔组织疾病等疾病的患者；按照GOLD诊断分级标准[6]，轻度13例，中度11例，重-极重度7例。其中男18例，女13例，年龄55～85岁，平均年龄（69±6）岁。对照组为同期健康体检者9例。各组患者性别年龄构成比均无统计学意义。本研究经苏州大学附属三院伦理委员会审查批准。凡符合入选标准的患者均告知本研究的目的及试验方法，并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本收集：AECOPD患者入院后24 h内抽空腹静脉肝素抗凝血5 mL，后给予抗生素为主的综合治疗，如患者咳嗽、咳痰、喘息、呼吸困难、发热等症状明显好转（呼吸困难、咳嗽、咯痰和喘息等症状稳定或症状轻微，有发热者体温已降至正常3 d），并结合血常规、C反应蛋白、血沉、痰培养、胸部影像学等检查结果抽空腹静脉肝素抗凝血5 mL。对照组抽空腹静脉肝素抗凝血5 mL。

1.2.2 实时荧光定量RT-PCR法检测IL-33的表达：提取每个外周血标本分离的单个核细胞，采用Trizol法提取总RNA，按照操作说明书进行，反转录成cDNA，保存于-20 ℃中备用。IL-33引物：上游5′-AAATGAATCAGGTGACGGTGTT-3′，下游5′-CC ACAGAGTGTTCCTTGTTGTTG-3′；内参β-actin引物：上游5′-AAGGTGACAGCAGTCGTT-3′，下游5′-TGTGTGGACTTGG GAGAGG-3′。总体系为20 μl，主要反应条件：94 ℃预变性30 s，之后94 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，共进行40个循环后进行溶解曲线的检测。每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数定义为Ct值；每对引物在每个模板中做2个重复管，得到的Ct值取平均值；IL-33基因的Ct平均值减去β-actin的Ct平均值，得到△Ct。IL-33基因的表达量用2-△Ct表示。

1.2.3 统计学处理：采用SPSS13.0软件，各组数据以均数±标准差（x¯ ±s）表示；组间比较采用单因素方差分析，多个样本之间的两两比较采用SNK-q检验，同组患者治疗前后比较采用t检验，P＜0.05为差异有显著性。

2 结 果

31例AECOPD患者历经综合治疗后，除2例重-极重度患者未能达到COPD稳定期，余29例患者病情均得到明显好转，处COPD稳定期。

实时荧光定量RT-PCR法检测40例入院对象外周血单核细胞中均有IL-33基因表达，对照组及轻度COPD患者其基因表达维持在低水平，中度和重-极重度患者IL-33mRNA表达明显增加，反映IL-33水平与病情严重程度成正相关。COPD患者病情变化、急性加重时，IL-33基因表达水平呈显著升高，积极治疗后如病情能得到有效缓解，IL-33mRNA表达也能随之同步下调，反之则维持在较高水平。

表1 各组患者外周血中单个核细胞IL-33基因表达的动态变化（）

表1 各组患者外周血中单个核细胞IL-33基因表达的动态变化（）

组别 例数 IL-33急性加重期 缓解期对照组 9 6.434E-06±2.000E-06轻度COPD组 13 3.842E-04±2.185E-043.216E-05±2.491E-05中度COPD组 11 1.817E-02±0.304E-029.335E-03±2.692E-03重-极重度COPD组 5 6.329E-02±2.335E-022.693E-02±0.339E-02

注：无论是COPD急性加重期还是缓解期，各组之间均有统计学差异，每组治疗前后、即急性加重期与缓解期之间也均有统计学意义

表2 两例重-极重度COPD未缓解患者治疗前后外周血中单个核细胞IL-33基因表达的动态变化

图1 实时荧光定量RT-PCR扩增曲线

图2 实时荧光定量RT-PCR溶解曲线

3 讨 论

COPD气道炎症的本质、特点及其炎症机制认识尚不十分明确，但目前普遍认为COPD是一种复杂的慢性气道炎症，涉及多个方面的病理生理过程，包括激活的炎性细胞释放的多种递质。细胞因子是机体许多细胞特别是免疫细胞合成和分泌许多种微量的多肽类因子，它们在细胞间传递信息、是具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。细胞因子依据其分泌来源不同，分为Th1型细胞因子（如IL-2、IL-12、IL-18等）和Th2型细胞因子（如IL-4、IL-5、IL-13等），近年来有关Th1型/Th2型细胞因子平衡的变化与COPD关系的研究进展非常迅速，这些研究初步阐明了人类Th1型/Th2型细胞因子参与CPOD的病理和生理作用，并为Th1型/Th2型细胞因子介导的COPD的临床治疗提供了理论依据[3]。Th2型细胞因子优势是COPD发病机制之一，Th2型细胞因子可削弱机体对感染因子的保护性防御机制，并常可能在遗传易感的宿主引发过敏性特应征[7]。矫正Th1型/Th2型细胞因子二者之间的失衡，促使它们保持动态平衡，将十分有利于COPD转归。

IL-33是新近发现的Th2型细胞因子。IL-33信号转导调节基因的转录，导致Th2型细胞因子如IL-4、IL-5和IL-13等的产生和随后的生物学功能发挥[8]。研究发现，IL-33通过其受体激活信号传导通路后可以加重黏膜组织的病理性损伤[9]。Komai-Koma等[10]发现IL-33是一种体内外Th2细胞的有力的趋化剂，在体外，重组IL-33能增加Th2细胞的比例、以IL-33浓度依赖的方式诱导Th2细胞形态学上的改变并使其迁移进入胶原基质；在体内则吸引过继转移的Th2细胞到IL-33注射的部位。因此，IL-33通过主动募集Th2细胞到炎症位点，而使IL-33在维持炎症中起关键的作用。在体外实验中[9]，重组人IL-33（rhIL-33）与Th2细胞孵育能增加Th2细胞产生IL-5和IL-13，而rhIL-33与Th1细胞孵育能降低Th1细胞产生干扰素的水平。用rhIL-33进行体内研究[9]发现，将rhIL-33腹膜内注射到小鼠后导致小鼠的胸腺、脾、肝和肺中IL-4和IL-5 mRNA水平增高，血清中IL-5和IL-13水平增高。同时，rhIL-33处理小鼠引起严重的肺和消化道的病理改变，包括免疫细胞浸润、黏液产生增加和上皮增生与肥大[9]。

因此，IL-33不仅是Th2型细胞因子的代表，它更可以生成其他Th2型细胞因子如下游的细胞因子IL-4、IL-5、IL-13等加重Th2型细胞因子优势作用，通过削弱机体会感染的防御能力、增加宿主气道高反应等机制促进COPD病情进展恶化，是反映病情的可靠指标之一。

本研究中纳入40例研究对象，分成四组，从健康者、轻度COPD患者、中度COPD患者至中-重度COPD患者，构成完整的病情梯队，代表了COPD病情各个阶段的严重程度，分别检测40例患者外周血单个核细胞中IL-33基因表达情况，结果提示其表达水平与病情严重程度同步上调，感染诱发COPD急性加重时升高尤为明显，且治疗后病情获得缓解时IL-33基因表达也随之下降，提示IL-33可能参与COPD发生、发展及恶化过程，是COPD病情变化及转归的预警信号之一，阻断IL-33靶点或许是未来治疗COPD的有效手段。但本课题样本量偏小，尤其是治疗后无明显缓解的AECOPD患者仅为两例，尚不能构成统计学意义，课题组将后续扩大样本量进一步深入研究。

[1] Zhong NS,Wang C,Yao WZ,et al.Prevalence of chronic obstructive pulmonary disease in China: A large, populationbased survey[J].Am J Respir Crit Care Med,2007,176(8):753-760.

[2] Kelly Freeman ML.Clinical Considerations for Roflumilast:A New Treatment for COPD[J].Consult Pharm,2012,27(3):189-193.

[3] Singh M,Lee SH,Porter P,et al.Human rhinovirus proteinase 2A induces Th1 and Th2 immunity in patients with chronic obstructive pulmonary disease[J].J Allergy Clin Immunol,2010,125(6):1369-1378.

[4] Kurowska-Stolarska M,Kewin P,Murphy G,et al.IL-33 Induces Antigen-Specific IL-5+ T Cells and Promotes Allergic-Induced Airway Inflammation Independent of IL-4[J].J Immunol,2008,181(7):4780-4790.

[5] Snow V,Lascher S,Mottur-Pilson C,et al.The evidence base for management of acute exacerbations of COPD: clinical practice guideline, part 1[J].Chest,2001,119(4):1185-1189.

[6] 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南[J].中华结核和呼吸杂志,2007,30(1):8-17.

[7] Liang F,Huang N,Wang B,et al.Shear stress induces interleukin—8 mRNA expression and transcriptional activation in human vaseular endothelial cells[J].Chin Med J(Engl),2002,115(12):1838-1842.

[8] Liew FY,Pitman NI,Mclnnes IB,et al.Disease-associated functions of IL-33: the new kid in the IL-1 family[J].Nat Rev Immunol,2010,10(2):103-110.

[9] Schmitz J,Owyang A,Oldham E,et al.IL-33, an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines[J].Immunity,2005,23(5):479-490.

[10] Komai-Koma M,Xu D,Li Y,et al.IL-33 is a chemoattractant for human Th2 cells[J].Eur J Immunol,2007,37(10):2779-2786.

The Study of the Expression of IL-33 in Patients with COPD and it's Dynamic Changes with Different Respond to Treatment

GUAN Shu-hong, ZHOU Jun, XU Qian-qian*
(Third Affiliated Hospital of Suzhou University, Changzhou 213000, China)

Objective To study the expression of Interleukin-33(IL-33) in patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and its dynamic changes with different respond to treatment. Methods 31 patients with acute exacerbation chronic obstructive pulmonary disease (AECOPD) were grouped according to the GOLD COPD classifications: mild group, moderate group and severe-very severe group. The expression of IL-33 mRNA in peripheral blood mononuclear cells was determined by Real-time fluorescent quantitative RT-PCR before and after treatment. Results The expression of IL-33 mRNA was maintained at a low level in control group and mild group, but significantly increased in moderate group and severe-very severe group. The upward trend was especially apparent in COPD patients at acute exacerbation phase. When condition improved, the level was downwad. Conclusion The expression of IL-33 in patients with COPD is increased with the severity of the disease and changed simultaneously when condition deteriorated or improved.

Interleukin-33; Chronic obstructive pulmonary disease; Real-time fluorescent quantitative RT-PCR

R563.9

：B

：1671-8194（2014）31-0003-02

江苏省2013年省级前瞻性研究专项资金（BE2013629）

*通讯作者:E-mail: 48257304@qq.com