西双版纳自然环境试验站环境真菌的鉴定

肖建军，赵远荣，刘 剑，杨玉萍

（云南北方光电仪器有限公司，昆明 650114）

前言

西双版纳自然 环境试验站始建于1962年，隶属于中国兵器工业集团公司第二九八厂，是国防科技工业环境试验与观测站网十大自然试验站之一，也是国家材料环境腐蚀试验台网的示范站，是我国唯一一个热带雨林环境试验站。试验站位于云南省西双版纳州景洪市大勐龙镇，东经100°4022″，北纬21°34′48″，海拔为626 m，距昆明789kg，距景洪59km；年平均温度21.6℃，年最高温度为34℃～38.3℃，平均相对湿度83%，平均日照时数1716h，平均降雨量1713mm，年辐射总量3651MJ/m2，雨水pH值为6.6；属于典型的热带雨林气候[1]。由于西双版纳自然环境试验站属于典型热带雨林气候环境，霉菌生长旺盛，对光电材料、高分子材料、涂料、油脂材料的老化和霉蛀，以及对金属材料的腐蚀非常明显，是开展环境试验、霉菌试验防霉研究的理想场所。

本研究对试验站环境中的真菌进行分离，采用真菌的经典分类和ITS区间序列相结合的方法对主要类群进行鉴定。以了解试验站环境中主要真菌类群，从而更好的开展环境试验与霉菌试验防霉研究。

1 材料与方法

1.1 培养基（g/L）

PDA培养基（马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20）；马丁培养基（葡萄糖1 0，蛋白胨5，K H2P O41，MgSO4·7HO20.5g，孟加拉红0.033，琼脂20）；沙保弱培养基（葡萄糖40，蛋白胨10，琼脂15）；麦芽汁琼脂培养基（麦芽汁5°Be′，琼脂20）；察贝克琼脂培养基（NaNO33，K2HPO41，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，FeSO4·4H2O 0.01，蔗糖30，琼脂18）；诱发真菌孢子的培养基（KH2PO41，MgSO4·7HO20.5g，KNO31，KCl 0.5，淀粉0.2，蔗糖0.2，葡萄糖0.2，琼脂20）。

1.2 主要试剂和仪器

2×Power Taq PCR MasterMix购自昆明硕阳科技有限公司，引物ITS1和ITS4由大连宝生物有限公司合成。超净工作台（SW-CJ-IC，苏净集团安泰公司）；恒温培养箱（PYX-DHS-40×50，上海市跃进医疗器械一厂）；光学显微镜（B H-2，日本OLYMPUS）；电泳仪（POWER PAC 3000 美国BIO-RAD)；凝胶成像仪( SYDR/1305 美国Syngene 公司)；离心机( 美国Thermo 公司)；PCR扩增仪( PTC-200 美国MJ Re sarch 公司)。

1.3 真菌的分 离

采用自然沉降法收集分离环境试验站真菌：将装有培养基的培养皿放置于离地面1.5 m处，打开培养皿盖子1-3 min后，盖上皿盖，静置于28℃±1℃的培养箱中3～7 d。挑取单菌落的菌丝或孢子于PDA斜面上进行 纯化和保藏。

1. 4 真菌的鉴定

1.4.1 形态观察

采用插片和点植培养方法，对分离得到的菌株通过显微形态和菌落形态特征的观察进行属的鉴定，鉴定检索参照文献［2～7］。

1.4.2 DNA的提取和PCR扩增

D N A 的提取方法参照[8]；I T S 区间序列的P C R 扩增参照文献[9]。引物I T S 1（5′-T C C G T AGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′）。PCR扩增程序94℃10 min；94℃45s，54℃1min；72℃1min，35个循环；72℃10 min。1%琼脂糖凝胶检测扩增的目标产物。所得产物送上海某公司测序。

2 结果与分析

本次试验从试验站环境中收集分离82株真菌，根据菌落形态及其出现的频率将其合并成16株：F1-7、F2-4、F2-12、F5-4、F7-5、F1-6、F2-1、F1-8、F2-6、F1-9、F4-1、F3-5、F3-9、F3-13、F6-2和F2-2，其中F1-7、F2-4、F2-12、F5-4和F7-5出现频率最高，为本次分离真菌的主要类群。

2.1 分类鉴定

采用插片和点植培养法，对16株真菌进行显微形态和菌落形态的观察，结果归属为2个纲、4个目、5个科、10个属。见表1。

从表1看到，16株环境真菌为丝孢纲的最多，有13株；丝孢目的有11株，占68.75%，暗色孢科和丛梗孢科的各有7株和4株，分别占43.75%和25%。

2.2 种的鉴定

对5株主要类群的菌株（F1-7、F2-4、F2-12、F5-4和F7-5）进行DNA的提取和ITS区间序列的PCR扩增，将目标产物送到上海某公司测序。将所获得的序列采用DNAstar软件进行图谱分析，进行人工校对，校正后的序列在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索(BLAST search)，选取与供试菌株关系较近的相关菌株序列，用ClustalX 1.8软件进行多序列比对，用Meg 4. 0软件的邻接法Neighbor-Joining，进行1000次Bootstrap检验后构建系统发育树（见图1）。

通过插片法观察菌株的菌丝有无隔膜、直径和 颜色，孢子梗和分生孢子的着生方式、形态大小和颜色等和点植培养法观察菌落的生长状况（质地、颜色、生长速度及特性等），分子孢子梗束、分生孢子座和刚毛的有无；结合ITS区间序列分析结果，确定了5株菌的分类学地位（见表2）。其中菌株F1-7 ITS区间序列分析结果与Periconia sp. CY198（HQ608027）的相似性为99.8%，与Periconia macrospinosa OTU310（JQ846071）的相似性仅为95.8%，所以本次只能将它鉴定为黑团孢属Periconi，将它视作1个潜在的新分类单元。其余4株分别鉴定为十字斯氏格孢Spegazzinia tessarthra，黄绿木霉Trichoderma aureoviride，黑曲霉Aspergillus niger，Dissoconium dekkeri．

表1 西双版纳自然环境试验站真菌的分类鉴定

3 讨论

图1 基于ITS 区间序列和Neighbor-Joining 分析绘制的系统发育树

表2 西双版纳自然环境试验站5 个主要真菌类群的分类学地位

本次对西双版纳自然环境试验站的环境真菌进行收集、分离和鉴定表明，试验站环境中的真菌种群较多。中华人民共和国国家军用标准GJB 150.10A-2009中所选用的环境试验霉菌主要以曲霉属Aspergillus、青霉属Penicillium为主，还有木霉属Trichoderma、球毛壳属Chactomium、帚霉属Scopulariopsis和拟青霉属Paecilomyces；本次收集分离的环境真菌除有曲霉属、青霉属和木霉属真菌外，其余除斯氏格孢属Spegazzinia的6个属真菌均为病原菌，其中的黑团孢属真菌还是腐生菌；弯孢霉属Curvularia真菌不仅是禾本植物的寄生菌和腐生菌，还能参与生物降解，定殖并降解纤维素材料，广泛分布于热带和亚热带地区，主要分布于空气中；芽枝霉属Cladosporium真菌能导致食品、织品的腐烂，并能引起多种植物病害，有些还能引起人及畜类疾病[10～12]。除中华人民共和国国家军用标准GJB 150.10A-2009中所选用的环境试验霉菌外，本次分离的黑团孢属、弯孢霉属和芽枝霉属真菌可能会对军工产品有一定的腐蚀性，在环境试验和霉菌试验防霉研究工作方面作为试验霉菌来研究将有很好的科学意义。

[1]西双版纳自然环境试验站[J].装备环境工程,2009,6(2):98-99.

[2]魏景超．真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社,1979．

[3 H.L.巴尼特,B.B 亨特(著),沈崇尧(译)．半知菌属图解[M].北京：科学出版社, 1977．

[4]邢来君,李明春．普通真菌学[M].北京：高等教育出版社,1999．

[5]Qiong Wu, Yaqian Li, Yingying Li, et al. Identif ication of a Novel Fungus, Leptosphaerulina chartarum SJTU59 and Characterization of Its Xylanolytic Enzymes[J]. PLOS ONE, 2013,8(9):1-14.

[6]P.W. Crous, B.A. Summerell, A.J. Carnegie, et al. Novel species of Mycosphaerellaceae and Teratosphaeriaceae[J]. Persoonia,2009,23:119-146.

[7]赵国柱.中国砖格丝孢菌20 属的分类及5 个相似属代表性种的分子系统学研究[D].北京:农业大学,2003.

[8]Nisiotou AA, Spiropoulos, Nychas G-JE AE. Yeast Community Structures and Dynamics in Healthy and Botrytis-Affected Grape Must Fermentations[J]. Appled and Enviornment Microbiology.2007,73(21):6705-6713.

[9]White TJ, Bruns TD, Lee S, Taylor JW. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M].PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. 1990, 18, 315-322.

[10]姜于兰.中国中西部亚热带及川西高原地区土壤暗色丝孢菌分类研究[D].泰安:山东农业大学,2007．

[11]雷亚萍.中国南方3 省区煤污病和蝇粪病病原菌多样性研究[D].陕西:西北农林科技大学,2011．

[12]张中义,冷怀琼,张志铭等.病原真菌学[M].成都：四川科学技术出版社,1991．