无创胎儿RhD分型的研究进展与临床应用＊

龙宇鹏 综述，任 君审校

（中国人民解放军第324医院检验科，重庆400020）

在妊娠期，Rh血型D抗原阳性胎儿的红细胞可从胎盘漏出进入RhD阴性的母体内，促使其免疫系统产生的RhD抗体，并进入胎儿循环并导致胎儿和新生儿发生同种异体的免疫反应；在分娩时，大量的RhD阳性胎儿红细胞可进入母体，诱发RhD阴性血的母体对Rh因子产生抗体，在以后的妊娠中，这些抗体再通过胎盘进入胎儿循环，攻击胎儿的RhD阳性红细胞，引发了胎儿和新生儿溶血病（hemolytic disease of the fetus and newborn，HDFN），主要表现为溶血性贫血引发的胎儿水肿、黄疸、核黄疸以及胎儿宫内死亡或新生儿死亡[1]。在孕晚期和分娩过程中，D抗原的风险最高，但D型的免疫反应也可以发生在早孕和中孕期[2]。胎儿和新生儿溶血性疾病的治疗取决于胎儿贫血的严重程度，而使用超声多普勒测定大脑中动脉的收缩期流速是确定胎儿贫血的一种安全、快速的方法。若病情较轻，胎儿可通过增加红细胞生成来代偿红细胞的破坏。若病情进一步加重则需要进行宫内输血治疗或剖宫产终止妊娠，胎儿出生后仍需要进行血液交换或完全性的输血治疗。因此，D型免疫反应是导致HDFN这一严重威胁胎儿和新生儿生命的疾病的主要原因。本文将对目前国内外关于胎儿RhD的无创分型检测的研究进展及其在临床的应用作一综述。

1 胎儿和新生儿溶血病研究进展

在无免疫预防措施的20世纪50年代，HDFN的发病率高达1／2 200。到了20世纪60年代晚期，随着新生儿预防性注射抗D免疫球蛋白的广泛应用，RhD阴性血妇女发生D抗原反应的频率从17%降到1%左右。后来又有研究认为，胎儿出生前进行预防性抗D治疗可以将免疫反应降至0.2%[3]。因此现在普遍采用多次产前结合产后预防性注射免疫球蛋白将免疫反应的风险降到最低，产前可以在孕28～29周时单次注射250～300μg或选择在孕29、34周时分别注射150μg免疫球蛋白；而出生后的预防通常在出生后72h内给予单次注射。以往RhD阴性血的孕妇应常规在分娩前进行预防性治疗，因为胎儿的血型直至出生后才能确定。但在欧洲血统的人群中，有40%的RhD阴性孕妇所怀胎儿也是RhD阴性，因此这部分患者不存在D抗原免疫的风险，造成了一定程度的过度治疗[3]。

随着非侵入性产前诊断技术的发展，出现了母体血中无细胞的胎儿游离DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）的无创分析策略，使胎儿RhD血型可以在出生前得到准确的预测，预防性免疫球蛋白的治疗也更具靶向性。目前这一筛查技术已经在欧洲乃至全球铺展开来，并且在丹麦、荷兰、芬兰、比利时、瑞士、法国和英国等国胎儿RhD分型已经成为产前检查的常规项目[3]。也有一些国家将胎儿RhD分型作为RhD阴性孕妇的监测项目。

2 RhD血型的特点及临床应用

Rh血型系统由两个基因组成，均位于1号染色体上且位置接近（1p34-36.2），均含有10个外显子，并有94%的序列相同。RhD基因编码的RhD蛋白上携带有D抗原（RH1），RHCE基因编码的RhCE蛋白上携带有C或c、E或e抗原（RH2-5）。目前为止，Rh血型系统中已经发现50多种抗原，251个RhD等位基因和123个RHCE等位基因。这种多态性增加了从RhD基因型中预测D表型的难度。

携带有功能性RhD基因的个体通常表现为D表型阳性。而引起D表型阴性的最常见原因就是RhD基因的缺失，这也成为RhD阴性孕妇胎儿RhD基因检测的焦点。D阴性表型在不同人群中出现的频率分别为：欧洲15%～17%、非洲5%、亚洲3%。在非洲人群中，D阴性的表型可能是由于基因缺失，也有约66%的人是携带不编码功能的假基因；而不同的RhD等位基因表达的差异较大，可表现为不表达、弱表达或部分表达D抗原的类型，因此存在RhD基因型的个体并不一定都有D阳性的表型，约有0.2%～1.0%的欧洲人群为D抗原弱表达，部分D表达的人则更少[4]。还有一类表型是DEL型，即只有在抗D抗体吸收和洗脱后才能检测到RhD表型，这类表型在亚洲人较为常见，在欧洲人群较少，仅占1／350～1／2 000[5]。携带有D抗原部分表达基因型的孕妇也应被归为D阴性人群，并接受预防性治疗，因为这类患者也可能与D阳性的胎儿产生免疫反应[6]。由此可见，带有以上的这些RhD基因型的孕妇，其胎儿RhD基因检测的复杂性显著地升高。

3 母血中的胎儿游离DNA及临床检测

胎盘合体滋养层含有细胞滋养细胞来源的胎儿细胞核，合体滋养层发生凋亡后可释放大量的凋亡小泡进入母体外周循环，小泡中包含的胎儿有核细胞的DNA片段会随着小泡的溶解、破裂而混入母血中，形成cffDNA。自从1997年在母体循环中发现cffDNA以来，国内外的众多研究团队均聚焦于这一领域，并在1998年创立了针对RhD阴性孕妇的“基于非侵入性实时PCR的胎儿RhD基因检测”技术。但cffDNA的生物学功能还远未阐明。

母血中cffDNA的主要特点是高度碎片化，通常为小于200bp的核酸片段；母血中的cffDNA的出现较早，在孕4～5周时即可检测到，但水平极低，直到孕7周以后才较为稳定，需到孕10～11周才能达到临床检测的标准。而且在整个孕期母血中cffDNA的水平均较低，波动在1～1 000copy／mL，从早孕期的20～25copy／mL开始逐渐升高，在中孕期含量约为32 copy／mL，直至晚孕期接近1 000copy／mL才较为容易检测，分娩后1～2d即消失[7]。母血中cffDNA的水平波动和变异较大，主要是由于容易受到DNA提取方法、检测技术、定量和定性手段等因素的影响，但根本的原因还是母血中cffDNA水平较低[8]。

实时荧光定量PCR（RT-PCR）法是目前胎儿RhD分型的主要技术[9]，其他用于分析cffDNA的方法包括：基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）[10]、数字 PCR（digital PCR）和新一代测序技术（NGS）[11]。对于胎儿 RhD分型而言，母血中cffDNA的低水平所导致的最严重风险就是检测结果的假阴性。此外，由于母体血浆cffDNA在孕早期很难检测到，因此在早孕期检测假阴性的风险最大，但中孕和晚孕期也有假阴性出现[6]。对于临床母血cffDNA的检测，最关键的是要确保检测方法的高稳定性和高敏感性以避免假阴性结果出现，必须注意以下几点：（1）保证全血和血浆中胎儿DNA的稳定；（2）保证DNA的高提取率；（3）保证足量的胎儿DNA可用于分析检测。另外，母血中胎儿DNA的水平还受到运输、处理、离心和保存等分析前的条件影响，必须严格操作。

既往研究表明，cffDNA在母体全血和血浆中均非常稳定，并可以在EDTA管中进行数天的运输，而不影响胎儿RhD分型的实时PCR检测结果。cffDNA对环境温度的适应性也较好，血样可在室温或4℃中保存或运输多日而不影响DNA水平。长时间的储存和运输可导致母体DNA的升高，同时cffDNA比例下降，但这并不会对基于RT-PCR的胎儿RhD检测法造成负性的影响[12]。DNA的高提取率可以通过多种DNA提取方法实现，包括手工提取试剂盒（病毒核酸提取试剂盒、循环血核酸试剂盒等）和具有高提取度、高重复性、低误差率的自动DNA提取法[13-14]。为获得足量的cffDNA，可以增加母血样本的总量，目前的方法已经可以达到使用1～4mL母体血浆检测胎儿RhD血型的水平。检测敏感性的增加与所用方法和策略密切相关，采用多个DNA作为靶标（双外显子联合法、多重标记法等）可以显著地增强测定的敏感性[14]。针对cffDNA碎片的特性，临床检测应使用短的PCR扩增子以获得更多完整的模板DNA分子和更高的敏感性[15]。

4 胎儿RhD基因检测策略

运用PCR方法检测RhD基因，需要扩增D阳性的变体，也需要高特异性的检测方法以区分RHCE。目前的检测包括RhD的5、7和10号外显子等多个靶点，可单独检测也可联合检测[16]。但多数学者均推荐至少检测2个外显子[17]。有研究采用4、5、6和10号外显子的联合检测将RhD阴性、阳性与RhD假基因、RhD-CE-Ds变体进行区分，其准确率可达到100%[18]。但是单独检测5号或10号外显子均有因该外显子为阴性而出现假阳性的检测结果[19]。也有胎儿RhD检测策略是使用10号外显子确定D抗原的变体，因为大多数杂合型等位基因均在此处隐藏；这种策略虽容易增加假阳性的预测结果，但对于临床诊断是必要的。另外，鉴于RhD基因频率的分布因地域差异而变，因此不同的实验室必须根据实际情况和胎儿RhD分型的临床目的（用于科学研究或人群筛查）设计检测的具体策略以适应当地的特殊人群[20]。

5 免疫异常孕妇的胎儿RhD分型

如果D抗原阴性孕妇的胎儿为RhD阳性，则导致其出现免疫异常，发生D型免疫反应的风险较大。因此，正确地评估这些孕妇发生D型免疫反应的风险对于这些孕妇的管理非常重要。若胎儿为RhD阳性，则需接受相应的监测和治疗；若为阴性则可以免受不必要的治疗。在全世界范围内，胎儿RhD分型都是一个综合性的需要高精度结果的临床服务项目。总体上，预测精确度和检测敏感性在过去的15年中有了极大提高，从95%提高至接近100%，孕早期进行产前预测的可靠性已达到较高水平[20]。而且，RhD阴性结果的检出必须明确，尽量减少假阴性的出现。为了增加胎儿RhD表型的准确性，常常采用多个外显子同时检测的策略[21]。在既往采用2种外显子分型的研究中已经得到了较高的准确性；此外，利用MALDI-TOF MS分析技术和早孕期的检测方法等也均已经得到了良好的检测结果，但是假阴性的结果依然无法避免。

为了保证胎儿D阴性表型预测的质量，可将通用的胎儿RhD阴性基因作为对照，也有利用多态性的标记结合Y染色体分析，或利用单核苷酸多态性进行分析。有研究认为，RASSF1A基因启动子甲基化BstUI抗性可能会成为cffDNA分析的可靠对照而广泛应用。但胎儿对照组必须与检测目标的敏感性在总体上相一致。有些研究为了保证检测质量，排除母体RhD基因变异对胎儿检测结果的掩盖，分别在不同孕周抽取血样进行独立检测。也有研究者采用两个RhD外显子检测联合总DNA作为DNA提取技术的对照。另外，数字化PCR近年来也应用于母血含有RhD变体的检测中，而且，数字化PCR、NGS等新兴技术可以克服传统RhD分型技术的局限，具有潜在的开发价值。为了达到临床应用和推广的目的，检测RhD的相关工作强度也必须符合常规的临床检验标准[22]。

与检测孕妇RhD血型不同，产前胎儿的RhD分型主要的研究目标就是降低假阴性率，而假阳性的结果不会导致严重的临床后果。作为筛查方案，必须采用高成本效率、高样本处理量和快速的检测方法。按照目前的RHD筛查经验，仅有极少数研究结果中出现了假阴性，且这些结果的出现并非由于母体血cffDNA的低水平，而是样本中混入杂质或处理失误所致[23]。

6 胎儿RhD分型与产前治疗方案

对于胎儿D抗原弱表达的孕妇，可以归为RhD阳性胎儿组，也可归为结果不明确组，在初诊时预防性使用抗D抗体进行治疗；但1～3型的弱阳性孕妇可以不必进行治疗[24]。对于携带有RhD假基因的孕妇也应按照上述方法归类并进行预防性治疗，并根据这些基因变体的频率涉及适当的方案，尽量排除不需治疗的个体。既往研究显示，有约0.3%～2.3%的孕妇因检测结果假阳性或归为结果不明确组而接受了原本不需要的预防性治疗，针对这部分患者的正确诊断仍有提升空间[3]。

胎儿RhD分型阳性的孕妇，产前靶向预防性治疗方案的实施需要一大群卫生专业人员的参与，包括专科医师、通科医师、助产士、实验室技术人员的工作和卫生管理机构的认可，参与者之间的通力协作对于方案的成功至关重要。越来越多的研究提示：高依从性是治疗项目实施和成功避免D抗原免疫反应的关键因素[23]。

然而，对于出生后的新生儿，脐带血血型检测原本是一种更加安全、廉价的RhD分型方法，同时也可以作为产前胎儿RhD分型结果不可信或不明确时的一种有效补救措施，但是最近在荷兰、丹麦等国被停用，其原因一方面是因为已经有研究显示其不能成为筛查结果的一个精确的标记，另一方面是其质量控制和保障尚不完善。美国国家生物标准和控制研究所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）已经制定了血浆的临床生物检测标准，规范的cffDNA检测标准尚未完成[25]。

7 小结与展望

综上所述，无创胎儿RhD分型技术是建立在cffDNA高度自动化、高敏感性检测的基础上，使用多种外显子作为检测靶点以降低假阴性率，必将发展成一种稳定的常规筛查方法，用以指导产前预防性治疗。在其广泛应用的过程中可从多个方面进行成本和耗费控制水平的提升：（1）采用简单、廉价、有效的方法提高检测敏感性，降低筛查的整体费用；（2）采用多种自动或手动的措施，降低假阴性率，减少不必要的产前治疗费用；（3）取代其他高成本的筛选或检测技术，获得更多的卫生经济学效益；（4）在孕早期进行确诊性筛查，及早发现RhD血型信息及其他免疫反应条件的信息，进行早期预防，节约后期治疗成本；（5）应用于 HDFN相关的其他同类血型抗原（Rhc、RhE、Kell、HPA等）的评估和检测体系中，减少其他抗原分型的研究和诊治成本。因此基于cffDNA的无创RhD血型检测技术是一项极具研究价值和临床价值的重要方法。

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