Twist基因与乳腺癌关系的研究进展

伏铠文，肖秀丽

(泸州医学院附属医院病理科，四川 泸州 646000)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重危害妇女健康，近年来其发病率呈逐年上升的趋势，在我国的部分地区已上升至女性恶性肿瘤发病率之首位[1]，并出现发病年龄年轻化的倾向，给乳腺癌的防治提出了挑战。近期的研究发现Twist基因在胚胎发育、诱导细胞移动及组织塑形中起重要作用，Twist基因异常表达与乳腺癌的发生、侵袭转移、血管生成及细胞耐药关系密切。本文就Twist基因与乳腺癌发生发展的关系情况作一综述。

1 Twist的结构和功能

不同的物种之间，Twist的DNA序列和其蛋白产物的氨基酸序列均呈高度保守特性，而且具有高度的同源性，其中小鼠源Twist和人源Twist氨基酸序列具有96%的相似性[2]。人类Twist基因位于染色体7p21．2，包含2个外显子和1个内含子，第1个外显子长为772 bp，内含子长为536 bp，mRNA全长1 669 bp，编码202个氨基酸组成的Twist蛋白[3]。Twist蛋白分子量约为21kDa，等电点为9.6，氨基末端具有极性亲水性，羧基末端无极性相对疏水性[4]。Twist基因是具有编码碱性的具有螺旋-环-螺旋结构域(basic-Helix-loop-Helix，bHLH)的转录因子，属于bHLH蛋白家族成员[3]。Twist基因在动物胚胎发育及分化过程中起关键调控作用，能够诱导细胞移动及组织塑形，高表达于胚胎期中胚层细胞[5]。

2 Twist与肿瘤相关因子的关系

目前的研究发现，Twist在多种肿瘤中表达上调，Twist通过调控肿瘤相关因子的表达，从而影响肿瘤细胞的凋亡、抑制分化，诱导上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，参与肿瘤的血管生成及肿瘤的耐药，在肿瘤的发生和发展中起重要作用。

2.1 Twist与P53

p53基因是至今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因[6]，具有调控细胞周期、维持基因组稳定、促进细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成等生物学作用。Twist作为转录因子可通过p53依赖或非依赖信号通道参与细胞周期及凋亡的调控，Twist的异常表达可以通过阻断P53肿瘤抑制通道，导致p53介导的细胞周期停滞，同时Twist的异常表达也抑制了P53的促进凋亡作用，导致肿瘤细胞的形成[7]。以往的研究证实p53发生突变后，发生癌变的概率将显著提升，在人类约75%的癌中均发现突变p53蛋白[8]。近年来对乳腺癌的研究发现Twist基因与P53基因启动子上的HOXA5相互结合，共同调节P53上游调控因子读码框蛋白(alternative reading frame，ARF)的表达，阻止p53翻译后的修饰，导致P53的失活，从而促进肿瘤细胞形成[9-10]。

2.2 Twist与VEGF

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)被认为是最重要的血管生成因子之一，它能够促进血管内皮细胞的生长和增殖。肿瘤血管生成在肿瘤的发生发展、侵袭转移和复发中具有重要作用，恶性肿瘤细胞的持续生长必须依赖于新生血管的形成，才能提供足够的营养和氧，带走代谢产物；VEGF在大多数恶性肿瘤均表达增加，并诱导肿瘤新生血管生成，改变新生血管通透性，促进肿瘤细胞进入血液，转移到远处组织[11]。Mironchik等[12]研究发现，用Twist转染乳腺癌MCF-7细胞系后VEGF的合成增加，接种Twist表达阳性的MCF-7细胞系到严重免疫缺陷小鼠体内，构建移植瘤模型，通过功能性磁共振成像(functional magnetic resonance imaging，FMRI)分析，发现肿瘤的血管容量增加且血管通透性增高，血管生成加快，肿瘤增大明显。Gerecht-Nir等[13]通过对人胚胎发育血管形成相关基因之一的VEGF表达的研究，也发现有Twist基因的表达上调。这些研究结果表明了Twist的异常表达可以促进VEGF的合成，与恶性肿瘤的生长转移密切相关。

2.3 Twist与E-cadherin和N-cadherin及EMT

众多研究表明EMT是肿瘤进展的重要步骤[14]，EMT的主要细胞学改变表现为上皮细胞失去极性及细胞间的粘附性、细胞骨架发生改变、细胞移动能力增加等，这些过程与上皮黏附素(E-cadherin)向神经黏附素(N-cadherin)转换密切相关[15]。 E-cadherin表达下调被认为是EMT的标志事件，而N-cadherin上调是细胞获得运动迁徙能力的显著标志。Twist基因作为转录因子通过对 E-cadherin和 N-cadherin表达的调节诱导了MET的发生[16]。而在乳腺患者癌中，Twist过量表达与其靶基因E-cadherin下调及N-cadherin上调显著相关，Twist能抑制E-cadherin的启动、促进EMT在肿瘤发病机制中扮演重要的角色[17]。Hennessy等[18]将人永生化乳腺上皮细胞(HMLE)经EMT诱导，获得的间质肿瘤细胞具有干细胞特征，Twist在内的各种EMT的诱导因素使乳腺癌干细胞表现出自我更新能力和多向分化能力，具有明显的进展期的乳腺癌细胞的特性，揭示了Twist及EMT有利于恶性肿瘤细胞脱离原发病灶，发生远处转移，促进继发性肿瘤的产生。Vesuna等[19]培养能稳定过量表达Twist的人乳腺癌细胞系(MCF-7/Twist)，发现Twist的过量表达诱导了EMT，而且有部分染色体发生异常和畸变，这也可能是肿瘤恶性程度增加，侵袭力增强的原因之一。

3 Twist与乳腺癌的关系

Yang等[20]通过对小鼠乳腺肿瘤细胞系体内和体外的系列实验研究，分析比较基因表达图谱发现：①Twist的异常表达与乳腺癌的侵袭和转移相关；②利用RNA干扰技术抑制乳腺癌细胞中Twist的表达，结果显示乳腺癌肺转移的数量与速率显著下降；③Twist结合到E-cadherin启动子区的E-box序列抑制其转录，导致E-cadherin介导的细胞间的粘附作用降低，同时诱导产生多种间充质标志物和增强了癌细胞的侵袭能力。根据这些研究结果和已知的Twist在胚胎期的调控作用，可以推测Twist能够通过EMT促进乳腺癌的侵袭转移。

近年来发现信号转导子与转录激活子3 (signal transducer and activator of transcription3，STAT3)也参与了乳腺癌的进展。Ling等[21]利用RNA干扰技术沉默STAT3的表达，观察小鼠体内乳腺肿瘤的生长状态，发现在敲除STAT3的细胞中Twist不表达，乳腺癌细胞的增殖率保持不变，而侵袭能力显著降低。该研究表明STAT3可以通过诱导Twist的表达，促进乳腺癌的转移。另一项针对乳腺癌的研究发现Twist基因启动子存在STAT3的结合位点，STAT3可以通过该结合位点调控Twist的转录，STAT3的活化增加了Twist的表达，而抑制STAT3的活性则Twist的表达将显著降低，将导致乳腺癌细胞的迁徙、侵袭和集落形成能力的减弱[22]。Cheng等[23]发现Twist可以诱导产生蛋白激酶Bβ(protein kinases，PKBβ，又称AKT2)，增加了细胞的致癌性，指出STAT3、Twist和AKT2形成一个功能信号轴参与乳腺癌细胞的侵袭和转移。以上研究表明STAT3 和Twist的表达水平之间存在强相关性，活化STAT3可以诱导Twist的表达，从而促进乳腺癌细胞的生长、浸润和转移。

一些微小RNA可能参与了乳腺肿瘤的转移，Ma等[24]研究发现microRNA-10b(miR-10b)在转移性乳腺癌细胞中高表达并调节其迁移和侵袭。Twist转录因子通过直接结合到miR-10b增强子来启动miR-10b的表达，而miR-10b又能抑制编码homeobox D10的翻译，从而导致转移基因—RhoC的表达增加。同时也发现，在原发性乳腺癌中miR-10b 的表达水平与临床进展关系密切。基于上述研究结果，可以推测Twist通过调控miR-10b的转录间接增加了RhoC的表达，从而促进乳腺癌细胞的侵袭和转移。

Eckert等[25]证明了血小板衍生生长因子受体α(platelet derived growth factor receptor-α，PDGFRα)是Twist的直接靶基因，Twist通过诱导PDGFRα的生成激活Src激酶，从而促进乳腺癌细胞侵袭性伪足的形成，这种伪足能降解细胞外基质，是导致恶性肿瘤侵袭性生长的关键结构，因此Twist间接诱发侵袭性伪足的形成被认为是乳腺癌细胞侵袭转移的一种新的机制。

4 Twist与乳腺癌的诊断及治疗

长期以来，组织病理学诊断是肿瘤诊断的“金标准”和临床治疗的基础。近年来的许多文献报道提示在不同的肿瘤类型和分期中，Twist的表达具有显著的差异性，例如何春年等[26]研究发现，Twist基因在甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)中的阳性表达率为100%，其灵敏度、特异度和准确度分别为100%，94.0%和78.0%，远高于对照组的滤泡状腺瘤(follicular adenomas，FA)和良性乳头病变(benign papillary lesions，BPL)，因此认为Twist可用于辅助诊断PTC，并可应用在对FA或BPL的鉴别诊断。Liu 等[27]研究发现，胃癌组织与正常胃组织中的Twist阳性表达率分别为93.9%和2.9%。Twist在鼻咽癌和鼻咽部黏膜组织的表达率也具有差异性[28]。这些学者的研究为我们提供了肿瘤诊断和鉴别诊断新的思路，即是否可以利用Twist在良恶性病变中的表达差异性，将其作为一种新的诊断和鉴别诊断的分子标志物，是否可以应用到乳腺癌诊断以及不同亚型乳腺癌之间的鉴别诊断？肖雄升等[29]做了相应的尝试，研究了三种恶性程度不同乳腺癌细胞中Twist基因和及其蛋白的表达情况，结果显示随着转移程度的增高Twist的表达也明显增高，由此提示可以通过检测乳腺肿瘤组织中的Twist基因及其蛋白表达水平初步判断乳腺癌细胞的恶性程度及转移潜能，为临床评判乳腺癌的转移、分期和选择综合治疗方案提供佐证。

化疗是治疗乳腺癌的重要策略，可以减少肿瘤的复发转移，有效提高乳腺癌患者总生存率和无病生存率，但与之伴随的肿瘤多药耐药性(multi drug resistance，MDR)的不断出现，从很大程度上影响了肿瘤的药物治疗，是导致乳腺癌患者化疗失败的主要原因之一。近年来的研究表明，Twist 在促进肿瘤进展的过程中，不仅能够抑制凋亡和通过EMT促进肿瘤转移，还能促进肿瘤细胞对化疗药物产生耐药现象[30]。Vesuna等[19]通过对人类多种乳腺癌细胞株的研究发现，在不同癌细胞株中Twist表达水平均不相同，且Twist表达水平高的乳腺癌细胞株较Twist表达低水平的乳腺癌细胞株对紫杉醇的耐药性强，在肿瘤细胞耐药相关基因激活导致发生耐药的同时，伴随着转移相关信号通路的激活，从而导致转移相关基因的表达增高，促进了转移的发生。另外，癌细胞的侵袭能力与多药耐药性之间存在着相关性，但具体机制尚不明确。Cheng等[31]研究发现，乳腺癌细胞中Twist上调Akt2的表达，抑制细胞凋亡，癌细胞的移动侵袭能力和对紫杉醇的耐药性将会增加，进一步通过RNA干扰技术证实AKT2是Twist下游的功能性调节介质，Twist-AKT2信号不仅可以增强癌细胞的侵袭能力，而且对抗癌药物产生耐药性也发挥重要作用。李军林等[32]对乳腺癌MCF-7/Twist稳定表达细胞株的多药耐药性研究，结果发现稳定表达Twist的细胞株对阿奇霉素、紫杉醇、长春新碱和羟喜树碱具有明显的耐药性，耐药相关分子P糖蛋白(P-glycoprotein，PGP)和乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)转录和表达明显上调。以上研究表明Twist的表达增强了乳腺癌细胞的多药耐药性，可能通过调控PGP和BCRP的表达，影响抗癌药物的摄取和外排。

越来越多的研究表明肿瘤治疗后复发的根源在于肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)的存在，CSCs具有自我更新、分裂增殖能力、DNA修复活性和耐药等特性，而其耐药性使CSCs能抵抗化疗药物的作用，因此，CSCs被认为是造成肿瘤耐药的最根本原因[33]。Li等[34]通过对乳腺癌MCF-7和宫颈癌Hela细胞的研究发现，Twist的表达上调可诱导与EMT相关的细胞形态学变化，导致癌细胞出现干细胞样特征，如肿瘤球的形成以及表达CD44和ALDH等干细胞标志物，并且推测Twist诱发EMT后，癌细胞产生耐药性是由于癌细胞具有了干细胞样特性。Banerjee等[35]研究发现ARTN可以维持细胞的干细胞样特性，促进了乳腺癌细胞的化疗药物耐药性和放疗辐射抵抗性，Twist通过调节ARTN蛋白的表达，对维持癌细胞的干细胞特性及其耐药性发挥重要作用。

5 结语

综上所述，Twist的异常表达，与乳腺癌的发生、发展、浸润、转移以及肿瘤的耐药性关系密切，可以帮助临床医生对乳腺癌的早期诊断、治疗、预后及有无复发转移做出更准确的判断。但是我们对Twist的生物学特性和在乳腺癌发生发展过程中的机制仍未完全明确，有待进一步研究。在现有研究的基础上，以Twist为重要诊断分子标志物和基因靶点的治疗将可能成为乳腺癌治疗的又一重要研究方向。因此，对Twist功能的进一步研究可能为乳腺癌及其他恶性肿瘤的治疗翻开新的篇章。

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