水貂肠炎病毒NS1基因进化分析

张海玲，张蕾，胡博，白雪，赵建军，刘昊，徐淑娟，苗立光，冯卓，闫喜军

(中国农业科学院特产研究所，长春 130112)

水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus，MEV)是猫泛白细胞症病毒(FPV)的变异体，可在肠系膜淋巴结和隐窝上皮细胞内高度复制，是以肠黏膜脱落和腹泻为特征的急性、烈性、高度接触性传染病的病原体[1，2]。在自然条件下，不同品种和不同年龄的水貂均有感染性，但幼貂感染性极强。MEV引起的水貂病毒性肠炎最早于1949年由Schofield报道，1952年由Wills分离、鉴定并命名为水貂肠炎病毒[3，4]。在我国，最早于1981年，由姜廷秀报道。目前，该病蔓延全国。随着特种养殖业的发展，病毒性肠炎已经成为危害水貂养殖的三大疫病之一，给养貂业带来巨大的经济损失[5，6]。

水貂肠炎病毒为单链线性DNA病毒，长约5000bp[7，8]，主要编码VP1、VP2、NS1、NS2 4种蛋白。其中，VP1、VP2为结构蛋白；NS1、NS2为非结构蛋白。NS1蛋白对MEV的复制具有重要调节作用。有报道称，NS1蛋白个别氨基酸的改变可能会影响到细小病毒的细胞嗜性。目前，国内尚无对MEV NS1基因的检测报导。本研究通过对国内4个地区的样品中MEV NS1基因的克隆测序，初步了解MEV NS1基因的变异特性，为以后对MEV NS1基因的研究及MEV的感染控制提供流行病学依据。

1 材料与方法

1.1 样品

将辽宁省、吉林省、山东省、河北省采集的发病致死水貂肠道组织低温冷冻处理后送至实验室，无菌加入10倍PBS，研磨，离心取上清液，冷藏待检。样品编号及详细信息见表1。

表111份水貂肠炎病毒阳性样品采集信息

Table1Informationsof11positivesamplescollectedfromminkenteritisvirus

样品编号SampleNO．省份Province年份YearsLN(08)1辽宁Liaoning2008LN(08)2辽宁Liaoning2008LN(08)3辽宁Liaoning2008JL(09)1吉林Jilin2009JL(09)2吉林Jilin2009JL(09)3吉林Jilin2009LN(09)1辽宁Liaoning2009LN(09)2辽宁Liaoning2009HB(09)1河北Hebei2009SD(09)1山东Shan⁃dong2009SD(10)1山东Shan⁃dong2010

1.2 质粒与菌种

大肠杆菌DH5a感受态细胞和pMD18-TVector(大连宝生物工程有限公司)。

1.3 主要试剂

MiniBEST Viral DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒、PCR 扩增试剂、Marker DL2000(TaKaRa公司)；DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒(Bioer公司)。

1.4 引物的设计与合成

参照GenBank MEV-B株序列(FJ592174)设计上、下游引物NS-1/NS-2、NS-3/NS-4，分2段测序，引物序列见表2。

表2水貂肠炎病毒NS1基因序列扩增引物

Table2AmplificationprimersofMinkenteritisparvovirusNS1gene

引物编号PrimerNo序列(5′-3′)Sequences退火温度(℃)ReturntemperatureNS-1CCATAGACCGTTACTGACATTCG53NS-2TACAGCTTGTGCTATGGCTTGAGNS-3AAATGATGGCACAACCAGGAGG56NS-4ACCTGGAGGCACAAGTCCTATAA

1.5 核酸的提取及PCR扩增

按照试剂盒提供的操作手册从组织样品研磨上清液中提取DNA。用PCR扩增目的片段。PCR反应体系：10×LATaqbuffer 5μL、dNTP(2.5mmol/L)4μL、引物NS-1/NS-2和NS-3/NS-4(50pmol/L)各1μL、模板DNA 1μL、LATaq酶0.25μL，加去离子水至50μL。PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 45min，54℃ 1min ，72℃ 2min，30个循环，72℃延伸7min。1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

1.6 重组质粒的克隆与鉴定

取4.5μL纯化产物与0.5μL pMD18-T载体(50ng/μL)进行连接反应，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于Ampicillin抗性平板，37℃过夜培养后，对单个菌落进行PCR鉴定。阳性菌落接种5mL含Ampicillin的LB营养液中培养增殖，提取质粒。用BamHI和HandIII 双酶切鉴定后，送TaRaKa公司测序。

1.7 序列比对、同源性及系统发育分析

将测得的上、下2段序列用DNAstar分子生物学软件进行拼接，并用DNAstar与GenBank公布的其他细小病毒序列进行比对同源性及系统发育分析，引用序列见表3。

表3引用参考序列

Table3Referencesequencecitedinthisstudy

编号NO毒株StrainsGenBank登录号GenBankAccessionNo基因型Genotype国家Country1CPV-bM38245CPV-2USA2CPV-13EU659118CPV-2aUSA3Cpv-2aAJ564427CPV-2aIndia4Fpv-CU-4M38246FPVUSB5MEVBFJ592174MEVChina6cpv-15AY787926CPVUSA7fpv-TU4AB000067FPVJapan8fpv-TU8AB000069FPVJapan9MEVAbashiriD00765MEVJapan10CAENFRA3009FN6695071FPVGermany

2 结果与分析

2.1 PCR检测及NS1基因序列分析

在送检的32份样品中检测出21份阳性样品，在检测的几个地区中均有阳性样品分布。每个地区选取1～3份时间、地点、临床症状有差异的样品共计11份进行NS1基因的克隆和测序，结果显示，NS1基因全长2007bp，编码668个氨基酸。核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为98.8%～100.0%和98.5%～100%；本次测序序列和国内毒株MEVB基因的核苷酸和推导氨基酸序列同源性为98.7%～99.9%和98.7%～99.9%；与国外毒株MEVAbashiri基因的核苷酸和推导氨基酸序列同源性为99.0%～99.5%和98.7%～99.1%。通过对11株肉食兽细小病毒株和已知的9株参考毒株NS1基因氨基酸序列比对，发现有34个氨基酸位点存在变异，见表4。

表4NS1基因变异氨基酸位点

Table4AminoacidvariationsitesofNS1genes.

病毒株StrainsMEVNS1氨基酸变异位点VariationsitesofMEVNS1aminoacid10233340438892128194222227247248249282286350进化分支EvolutionarybranchJL(09)1V----------QI----1JL(09)2V----------QI----1LN(08)1V----------QI----1LN(08)2V--R-R----DQI----1HB(09)1V----------QI----1LN(08)3V-------R--QI----1SD(09)1--G---L--I-------2SD(10)1-----------------2JL(09)3-----------------2LN(09)2-------R---------2LN(09)1V----------QI----3Cpv-13V----------QI----3Cpv-15V----------QI----3Cpv-bV----------QI----3Cpv-2aV----------QIGGQ-3MEVAbashiriV---H-----------N4

续表4

病毒株StrainsMEVNS1氨基酸变异位点VariationsitesofMEVNS1aminoacid10233340438892128194222227247248249282286350进化分支EvolutionarybranchFpv-CU-4VD---------------5Fpv-TU4V----------------5Fpv-TU8V----------------5病毒株StrainsMEVNS1氨基酸变异位点VariationsitesofMEVNS1aminoacid436443528540543544545572574576585595610616622629662进化分支EvolutionarybranchJL(09)1--NA--E-I----D-Q-1JL(09)2---A--E-I----D-Q-1LN(08)1---A--E-I----D-Q-1LN(08)2---A--E-I----D-Q-1HB(09)1---A--E-I----D-QG1LN(08)3---A--E-I----D-Q-1SD(09)1---A--E-I----DAQ-2SD(10)1---AS-E-IL---D-Q-2JL(09)3---A--E-I---GD-Q-2LN(09)2---A--E-I----D-Q-2LN(09)1-----FE-I--Q-D-Q-3Cpv-13------E-I--Q-D-Q-3Cpv-15------E-I--Q-D-Q-3Cpv-b------E-I--Q-D-Q-3Cpv-2aP----FE-I--Q-D-Q-3MEVAbashiri------E------D-Q-4Fpv-CU-4-V------I----D-Q-5Fpv-TU4-------K--E--D-Q-5Fpv-TU8--------I----D-Q-5

注：MEVB毒株(GenBank登录号：FJ592174)NS1基因氨基酸序列作为参考序列；“-”.与参考序列相同的氨基酸位点。

Note:Amino acid sequence of the strain MEVB NS1 gene(GenBank accession number:FJ592174)as the reference sequence;“-”.represents the same amino acid position with reference sequence.

2.2 NS1基因的系统发育分析

本次检测的11个样本主要分为3个分支，其中DL1与CPV-2a在同一分支(图1)。

3 讨论

水貂细小病毒、犬细小病毒(CPV)和猫细小病毒进化关系密切，其中，水貂细小病毒和犬细小病毒都是FPV的突变体[9]。三者在感染时都利用转铁蛋白受体[10]，但是，只有CPV能够感染猫肾和犬肾细胞，而且FPV和CPV二者宿主范围的不同主要是由于衣壳蛋白VP2的变异及VP2和犬或猫转铁蛋白受体(TfR)的相互作用[11，12]。

NS1蛋白对细小病毒复制具有重要的调节作用，MEV的NS1基因含有1个ORF，全长2 007bp，共编码668个氨基酸。在细小病毒NS1蛋白中含有1个长约150个氨基酸的保守区域，这段保守区域从389位氨基酸开始，并含有391GKRN394保守序列，在不同细小病毒中，这一区域的氨基酸相似性远远高于其他区域。在这段区域中含有与ATPase或GTPase相关的ATP或GTP结合位点，并具有解旋活性，是病毒DNA复制所必需的。本实验中所有测序序列均含有391GKRN394保守序列，但JL(09)1株在保守区域内发生了改变，在528位的D(Asp)到N(Asn)的突变，该处改变是否对NS1的抗原性产生影响，有待于进一步的研究。

MEV最早报道于1949年，CPV最早报道于1978年，虽然报道的时间相差很大，但现在还不能说明他们之间的关系及进化顺序。关于细小病毒的进化推测最多的就是MEV和CPV由FPLV进化而来。但CPV与MEV之间的亲缘关系较远。本试验中检测的序列独自分为2支。其中DL1与CPV在同一进化分支，其与CPV的氨基酸同源性高达99.7%，氨基酸位点相对于CPV未发生特异的改变，其是否显示了MEV与CPV的NS1基因发生重组，还有待进一步证实。

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