乌司他丁对脓毒症致急性肾损伤大鼠肾脏病理及尿相关指标的影响

2014-03-24曹波张琳琳柴春香等

中国当代医药 2014年6期

曹波　张琳琳　柴春香等

[摘要] 目的探讨乌司他丁对盲肠结扎穿孔术（CLP）所致大鼠脓毒症急性肾损伤肾脏病理及尿相关指标的影响。方法 SD健康雄性大鼠55只，按随机化原则分成3组：正常对照组5只、模型组25只、乌司他丁治疗组25只，后两组再随机分为5个时间点（1、6、12、24、48 h），每组每时间点各5只，采用CLP复制脓毒症模型，乌司他丁治疗组造模后立即给予乌司他丁100 000 U/kg，尾静脉注射，分别在各个时间点采血、留尿标本，处死大鼠摘取肾脏，进行肾功能血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN），尿肾损伤分子（KIM-1）、白细胞介素-18（IL-18）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）检测分析，光镜下观察肾脏病理变化。结果模型组SCr、BUN的浓度CLP术后6 h开始升高，24 h达高峰，48 h开始下降，均显著高于对照组（P<0.05），乌司他丁治疗组12、24、48 h均显著低于相应时间点模型组（P<0.05）。模型组尿KIM-1、NGAL、IL-18含量于CLP术后1 h开始升高，12 h达高峰，24 h开始下降，均显著高于对照组，乌司他丁治疗组6、12、24、48 h均显著低于相应时间点模型组（P<0.05）。肾脏病理改变明显好于模型组。结论乌司他丁对脓毒症所致急性肾损伤具有肾脏保护作用。

[关键词] 乌司他丁；脓毒症；急性肾损伤；肾脏病理

[中图分类号] R692 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）02（c）-0011-04

脓毒症并发急性肾损伤的发病率为19%～23%，当脓毒症并发急性肾损伤时，不仅给有效干预手段带来困难，增加患者死亡率，而且耗费巨大的医疗资源和巨额医疗费用，因此，及早防治脓毒症并发急性肾损伤，保护肾功能意义重大[1]。乌司他丁是从尿中分离纯化出来的一种糖蛋白，具有稳定细胞膜及细胞亚膜、稳定溶酶体膜抑制溶酶体释放、清除自由基、抑制炎症介质释放、改善微循环衰竭状态、抑制蛋白质分解代谢亢进等作用，并对多脏器损伤有保护作用[2-4]。本研究通过盲肠结扎穿孔术[5]（cecal ligation and puncture，CLP）建立脓毒症大鼠急性肾损伤模型，观察乌司他丁对脓毒症所致急性肾损伤的肾脏病理及尿指标变化，探讨乌司他丁对肾脏的保护作用及其机制，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

乌司他丁（广东天普生物化学制药公司）；肾损伤分子1（KIM-1）、ELISA试剂盒（美国R&D公司），白细胞介素18（IL-18）、ELISA试剂盒（武汉博士德公司），中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）、ELISA试剂盒（上海蓝基生物有限公司）。

1.2 实验动物和分组

SD健康雄性大鼠55只，体质量200～250 g，适应性喂养1周，实验大鼠按随机化原则分成3组。①正常对照组（n=5）：尾静脉推注生理盐水2 ml；②模型组（n=25）：行CLP；③乌司他丁治疗组（n=25）：行CLP后即刻尾静脉注射乌司他丁100 000 U/kg。模型组、乌司他丁治疗组，再随机分为5个时间点（1、6、12、24、48 h），每组每时间点各5只，术后均补充生理盐水3 ml/100 g抗休克。

1.3 动物模型制备

实验前禁食12 h，手术组采用经典的CLP复制脓毒症急性肾损伤模型，即用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔麻醉，无菌条件下沿腹中线切开长约2 cm，分离、结扎盲肠，在盲端肠壁用12号针穿刺2次，留置1条长1 cm宽2 mm、两头贯穿盲肠的橡皮片，挤出少许粪便，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁，编号，清醒后转入代谢笼内自由进水、进食。术毕补充生理盐水3 ml/100 g，术后自由饮食（水）。

1.4 留取标本

从术后腹壁缝合结束开始计时，分别于1、6、12、24、48 h取材，下腔静脉抽血5 ml，离心（3000 r/min）15 min，取血清于-20℃保存，待测血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）；膀胱分离，膀胱穿刺收集尿标本于-20℃保存，待测KIM-1、IL-18、NGAL；后放血处死大鼠，取左肾切开置于10%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，HE染色，光镜下×200下取3个视野观察肾脏病理变化。

1.5 指标检测

采用生化分析仪测定SCr、BUN。尿液标本均采用ELISA法检测KIM-1、IL-18和NGAL。

1.6 统计学处理

采用SPSS 17.0对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，应用独立样本t检验，两两比较用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肾脏的病理改变

HE染色光镜下，正常对照组肾小球、肾小管结构正常；模型组12 h开始出现炎性损伤，以24 h最为显著，表现为肾组织弥漫性单核-巨噬细胞浸润，组织间隙水肿明显，肾小管上皮细胞空泡变性、肿胀、脱落，甚至出现裸膜，部分肾小管腔闭塞，肾小管腔代偿扩张，管型形成；乌司他丁治疗组也存在单核-巨噬细胞浸润，组织间隙水肿，肾小管上皮细胞空泡变性、肿胀、脱落，部分肾小管腔闭塞，肾小管腔代偿扩张，管型形成，明显轻于相应时间点模型组。

2.2 大鼠肾功能的变化

CLP术后6 h，两组大鼠SCr、BUN的浓度开始升高，24 h达高峰，48 h开始下降，均显著高于对照组（P<0.05）。乌司他丁治疗组12、24、48 h较模型组相应时间点SCr、BUN均显著低，差异有统计学意义（P<0.05）；乌司他丁治疗组大鼠48 h时SCr、BUN的浓度明显回落，但仍然高于对照组（P<0.05）（表1、表2）。

2.3 两组大鼠尿KIM-1、NGAL、IL-18含量的变化

CLP术后两组大鼠尿KIM-1、NGAL、IL-18均于1 h开始明显升高，12 h达高峰，24、48 h下降，均显著高于对照组（P<0.05）。乌司他丁治疗组6、12、24、48 h较模型组相应时间点尿KIM-1、NGAL、IL-18含量显著低，差异有统计学意义（P<0.05）；乌司他丁治疗组大鼠48 h时尿KIM-1、NGAL、IL-18含量回落显著，但仍高于对照组（P<0.05）（表3～表5）。

3 讨论

临床实践中，脓毒症一旦并发肾脏损害，治疗难度明显增加，而且耗费巨大的医疗资源和巨额医疗费用。因此，及早防治脓毒症并发急性肾损伤，保护肾功能意义重大[8-9]。脓毒症致急性肾损伤的机制许多学者[1，4-6]认为可能是感染时所释放的毒素以及活化的炎性细胞和炎症介质释放，激活Toll样受体4，经过一系列级联信号传递，相互促进，形成炎症瀑布，从而启动后续的一系列病理生理改变，导致急性肾损伤。KIM-1是一种新的Ⅰ型跨膜蛋白，参与肾小管上皮组织形态和功能的恢复，在急性肾损伤后呈现高水平表达，并可在尿中检测出，在急性肾损伤大鼠模型的报道显示其升高明显早于其他传统检测指标的改变，可以作为急性损伤早期的检测指标和治疗效果评定指标[8-10]。NGAL是一种分泌性蛋白，研究表明，NGAL在正常肾组织中呈低水平表达，但在肾缺血/再灌注损伤和顺铂诱导小鼠肾损伤模型中，损伤后3 h时的尿液中即可检测到NGAL，明显早于尿NAG、β2微球蛋白及SCr的改变，是急性肾损伤的独立预测因子，也是目前基础实验中经常选用的评价急性肾损伤的指标[8，10]。IL-18被认为与脓毒症时脏器功能受损关系密切，IL-18能促进细胞凋亡，导致免疫功能紊乱，促进脏器功能损伤。曾有研究显示，在小鼠肾缺血性损伤模型中，IL-18在Caspase-1作用下被激活，激活后IL-18可裂解为成熟形式释放入尿，并可在尿中被检测出，是目前经常选用的评价机体炎性反应程度和治疗效果的指标[2，10]。有研究[10]证实KIM-1、NGAL、IL-18联合检测在评价脓毒症致急性肾损伤程度及治疗效果方面有更高的价值。本研究中采用经典的CLP复制急性肾损伤模型，应用肾脏病理变化，评价肾功能传统指标SCr、BUN，及新型肾损伤标志物KIM-1、NGAL及反映炎性反应程度和治疗效果的IL-18来反映脓毒症大鼠急性肾损伤的变化。实验大鼠结果显示，肾脏病理：模型组12 h开始出现炎性损伤，以24 h最为显著，表现为肾组织弥漫性单核-巨噬细胞浸润，组织间隙水肿明显，肾小管上皮细胞空泡变性、肿胀、脱落，甚至出现裸膜，部分肾小管腔闭塞，代偿扩张，管型形成；CLP术后6 h，两组大鼠SCr、BUN的浓度开始升高，24 h达高峰，48 h开始下降，尿KIM-1、NGAL、IL-18均于1 h开始明显升高，12 h达高峰，24、48 h下降，均显著高于对照组。

乌司他丁是从尿中分离纯化出来的一种糖蛋白，主要通过静脉方式给药，给药后在肾与肝迅速积累，5 min达到峰值，其生物利用度为100%，半衰期为40 min，主要通过肾脏代谢，具有抑制多种水解酶的活性，减轻水解酶对组织器官的损害，稳定溶酶体膜、清除氧自由基及脂多糖、调控炎性介质释放，抑制血栓素、血管内皮素的升高，维持内源性血管活性物质的动态平衡，抑制凝血系统活化，改善重要脏器灌流，改善循环障碍，起到多脏器的保护作用[11]。炎性细胞因子及介质的释放在脓毒症造成肾损伤中起了关键的作用[4-6]；Aosasa等[12]揭示乌司他丁通过抑制单核细胞内蛋白激酶C及核因子-κB（NF-κB）信号转导通路来直接抑制TNF-α的翻译和分泌；Inoue等[13]在小鼠腹腔注射脂多糖成功制造脓毒症模型后给予乌司他丁干预能够降低致炎因子的生成；余剑波等[14]报道显示感染性休克炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-8生成和释放因乌司他丁的应用得到抑制；陆艳娟等[15]在脂多糖致大鼠多器官功能衰竭抗氧自由基的实验中证实乌司他丁能够纠正超氧化物歧化酶和丙二醛的恶性变化，对大鼠肝、肾组织有一定的保护作用；Nakatani等[16]在体外实验中发现，乌司他丁不仅抑制细胞外中性粒细胞弹性蛋白酶活性，还抑制其在细胞内的活性和分泌，从而抑制中性粒细胞介导的内皮细胞损伤；以上研究均从不同角度验证了乌司他丁在多脏器损伤中抑制炎症反应程度、抗氧自由基和治疗效果方面的优势，起到脏器保护作用。本研究结果发现，乌司他丁治疗组肾脏病理变化：光镜下存在单核-巨噬细胞浸润，组织间隙水肿，肾小管上皮细胞空泡变性、肿胀、脱落，部分肾小管腔闭塞，代偿扩张，管型形成，明显轻于相应时间点模型组；造模后在12、24、48 h较模型组同时间点SCr、BUN均显著低，于48 h时开始回落，但仍然高于对照组；尿KIM-1、NGAL、IL-18含量在造模后6、12、24、48 h较模型组相应时间点均显著低，差异有统计学意义，于48 h时含量回落显著，同样高于对照组。从乌司他丁治疗组病理变化、肾功能变化、反映肾损伤程度和炎症反应状态的指标变化分析，均起到了很好的肾脏保护作用，其机制可能与抑制炎症因子及介质的释放有关。

本研究通过CLP复制脓毒症急性肾损伤模型，经乌司他丁治疗，不论是肾功能指标，还是新型尿生物学指标的变化，肾脏病理的改善，均显示了很好的肾脏保护作用，推测可能通过抑制炎症介质释放、改善微循环衰竭状态等机制，达到对脓毒症急性肾损伤大鼠肾脏的保护作用。

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（收稿日期：2013-12-27 本文编辑：郭静娟）