美洲大蠊提取物CII-3体内外抗HSV-2实验研究

普小菲，罗亦佳，彭 丽，李 娇 ，曾 菁，牛春丽，彭 芳*

（1.大理学院药学与化学学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000；3.大理学院外国语学院，云南大理 671003；4.德宏州芒市人民医院，云南德宏 678400）

近年来，生殖器疱疹（genital herpes，GH）的发病率在许多国家不断上升，它已成为日益普遍的性传播疾病，据WHO估计每年GH的新发病例约2000万〔1〕。目前引起GH最常见的病因是HSV感染，其中90%的病原体是HSV-2（Ⅱ型单纯疱疹病毒，Herpes simplex virus-2）。目前，临床上抗HSV的首选药物为阿昔洛韦（acyclovir，ACV），它是核苷类药物，选择性高，对正常细胞毒性较小。然而，ACV口服吸收差，约15%～30%由胃肠道吸收，长期使用有一定副作用，可引起接触性皮炎及容易产生耐药性〔2〕。因此，研发高效、低毒、不易产生耐药性的抗HSV新药具有重要意义。昆虫是自然界中最大的生物类群，有着独特的免疫体系，它为天然药物的开发提供了一种新的资源。美洲大蠊（Periplaneta Americana）属昆虫纲蜚蠊目蜚蠊科，俗称“蟑螂”。自70年代以来，有研究人员对美洲大蠊进行了大量研究，先后开发出了美洲大蠊系列昆虫药品，如康复新液〔3〕、肝龙胶囊〔4〕、心脉隆注射液〔5〕等。但蟑螂药材中是否存在着抗病毒活性成分是不清楚的，因此本实验用美洲大蠊提取物CII-3进行了体内外抗HSV-2作用的研究，为美洲大蠊临床抗病毒应用提供参考依据。

1 实验材料

1.1 药物 美洲大蠊提取物CII-3为黄褐色冻干粉末，由大理学院药学与化学学院张成桂博士提供。制备方法：将美洲大蠊干燥虫体粉碎后，用15倍量95%乙醇冷浸提取3次，所得乙醇液合并、浓缩后得到浸膏。将浸膏上聚酰胺柱，依次用水和不同比例的含水甲醇洗脱，定量收集，分别浓缩。其中某一划段成分经冷冻干燥后即得到所需的样品。经过计算，所提取物占生药的比率为0.2%。注射用阿昔洛韦（湖北科益药业股份有限公司，批号：20120704-2）。

1.2 细胞与病毒 Vero细胞株（非洲绿猴肾细胞，中国科学院昆明细胞库馈赠）；HSV-2（II型单纯疱疹病毒，江苏省南通市疾病预防控制中心馈赠）。

1.3 动物 昆明种雌性小鼠，SPF级，体重（18±2）g，许可证号：SCXK（滇）NO.0020922，购于昆明医学院动物实验中心。

1.4 试剂盒 小鼠α肿瘤坏死因子（TNF-α）酶联免疫检测试剂盒；小鼠γ干扰素（IFN-γ）酶联免疫检测试剂盒；小鼠白细胞介素-2（IL-2）酶联免疫检测试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所。

1.5 仪器 电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司，METTLERAE240型）；电动离心机（金坛市恒丰仪器厂，LXJ-A型）；超低速离心机（SiG⁃mA 1-14型）；CO2培养箱（德国Heraeus公司，BB16UV/BB5060UV型）；酶标仪（美国BioTek公司，SN255939型）；超级纯水机（成都康宁实验专用纯水设备厂，KL-UP-UV-20型）；电热恒温水浴锅（上海-恒科技有限公司，HWS12型）；旋涡混合器（上海精科实业有限公司，XW-80A型）。

2 实验方法

2.1 美洲大蠊提取物CII-3对HSV-2的体外药效学试验

细胞存活率（%）=给药组OD值/正常细胞对照组OD值×100%

细胞生长抑制率（%）=100%-细胞存活率

TC50=Antilog［B+（50-＜50%抑制百分率）/（＞50%抑制百分率-＜50%抑制百分率）］×C

其中C=A-B，A=log（抑制率＞50%的药物浓度），B=log（抑制率＜50%的药物浓度）。

2.1.2 病毒滴度测定 待细胞长成单层后弃生长液，将稀释度为 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9的病毒液分别加到板内，每孔100 μL，每个稀释度设4个复孔，同时设正常细胞对照组。于37℃、5%CO2培养箱内培养72～96 h后，在倒置显微镜下观察细胞病变效应（Cytopatic effect，CPE），并判断结果，按下列公式计算组织细胞培养半数感染量（Tissue culture half infection dosage ，TCID50）〔6-7〕。

TCID50=病变率大于50%组稀释度的对数+距离比×稀释系数的对数

距离比=（大于50%组的病变率-50%的病变率）/（大于50%组的病变率-小于50%组的病变率）

其中“病变率大于50%组”是指病变率超过50%的最低组；“病变率小于50%组”是指病变率小于50%的最高组。

协议书附图主要是对陕西省乡级行政区域界线与1∶50 000制图数据进行了整合，并对界线两侧核实修正后的重要地物、地貌及主要地名等信息进行修改，利用附图模板通过制图编辑而成。

2.1.3 药物抗病毒实验（CPE法） 待细胞长成单层后弃生长液，用维持液分别将样品CII-3以2倍稀释至 5个系列浓度（100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL 和 6.25 μg/mL），阳性对照药ACV稀释至5个系列浓度（2.5 μg/mL、1.25 μg/mL、0.625 μg/mL、0.3125 μg/mL和0.156 μg/mL）。分别将上述系列浓度药液各100 μL与病毒稀释液（100TCID50）等体积混合后直接加到板内，每个浓度设4个复孔，设病毒对照组、正常细胞对照组及阳性对照组。置于37℃、5%CO2培养箱内培养72～96 h，当病毒对照组的细胞病变达到“++++”，细胞对照组正常时，CPE观察系列浓度药液对HSV-2感染细胞的综合作用〔8-9〕。

CPE的记录方法为：无细胞病变为“-”；1%～25%细胞出现病变为“+”；26%～50%细胞病变为“++”；51%～75%细胞病变为“+++”；76%～100%的细胞病变为“++++”。判断结果，并计算药物的IC50（半数抑制浓度，50%Inhibitory concentration）和TI（治疗指数，Therapeatic index）。

2.2 美洲大蠊提取物CII-3对GH小鼠的治疗作用取体重为18～22 g健康昆明种雌性小鼠72只，随机分为6组，每组12只，分别为正常对照组，模型对照组，阳性药ACV对照组，CII-3高、中、低剂量组。用微量移液器吸取50 μL HSV-2病毒原液于小鼠阴道内，用3 mm×3 mm×3 mm大小的明胶海绵塞住小鼠阴道口，1次/d，连续7 d。肉眼可见红肿、疱疹、破损、糜烂及分泌物增多等症状时视为造模成功。造模成功后，开始分别灌胃给药治疗，1次/d，连续给药10 d。CII-3的低、中、高剂量分别为50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg。ACV为100 mg/kg，给药容量为0.02 L/kg·d，模型对照组和正常对照组给予0.5 mL等量的生理盐水。在给药治疗10 d后，各组小鼠眼球取血于塑料试管内，于冰浴中放置1～2 h后，以4℃、4000 r/min，离心10 min，取上清于Eppendorf离心管内，-20℃保存待检。分别用ELI⁃SA试剂盒检测小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2的水平变化。各组小鼠眼球取血后，处死小鼠，取小鼠的胸腺和脾脏，用电子天平精密称其重量，并按如下公式计算脏器指数〔10-11〕。

脏器指数＝相应脏器重量（mg）/小鼠体重（g）

3 实验结果

3.1 美洲大蠊提取物CII-3的细胞毒性测定 经MTT法所测得的系列浓度药液的细胞存活率（%）结果显示：随着药物浓度的增大，美洲大蠊提取物CII-3的细胞毒性增大。当浓度为250 μg/mL、500 μg/mL、1000 μg/mL时，可见明显的细胞毒性，表现为细胞变圆、缩小和溶解破碎的细胞形态学改变。CII-3的 TC50值为190.55 μg/mL，TC0为100 μg/mL；阳性对照药ACV对正常Vero细胞的细胞毒性很小，其 TC50和 TC0值均大于 100 μg/mL；溶剂对照组（0.5%DMSO）没有细胞毒性，Vero细胞形态与正常细胞对照组无明显差别。见表1。

表1 美洲大蠊提取物CⅡ-3对Vero细胞的细胞毒性（±s，n=3）

表1 美洲大蠊提取物CⅡ-3对Vero细胞的细胞毒性（±s，n=3）

注：①ACV的浓度为100 μg/mL；②与正常细胞对照组比较*P＜0.05，▲P＞0.05。

CII-3 ACV 0.5%DMSO细胞对照20.7±0.8*99.4±3.00▲100.8±2.05▲100.0±0.0017.9±1.51*26.2±2.09*94.2±9.42112.0±9.12*115.0±4.58*

3.2 病毒滴度测定 CPE观察结果所示，HSV-2的TCID50为 10-4.52，即接种滴度为 10-4.52的 HSV-2 病毒液每孔100 μL，可导致50%的培养细胞产生细胞病变，实验用的病毒滴度为100 TCID50。见表2。

3.3 美洲大蠊提取物CII-3对病毒所致CPE的作用 美洲大蠊提取物CII-3有抗HSV-2活性，从最低稀释浓度药液至最高稀释浓度药液，其细胞病变程度逐渐减轻。阳性对照药ACV表现出很好的抗HSV-2活性，当ACV在0.625 μg/mL时仍能较好的抑制病毒所致病变。见表3。

表2 HSV-2的病毒滴度测定

美洲大蠊提取物CII-3的IC50值为28.71 μg/mL；ACV能显著抑制HSV-2，其IC50值小于0.31 μg/mL。以TC50/IC50计算TI结果，美洲大蠊提取物CII-3和ACV对HSV-2的TI值分别为6.64 μg/mL和大于322.58 μg/mL。见表4。

表3 美洲大蠊提取物CII-3对HSV-2所致细胞病变的作用

表4 美洲大蠊提取物CII-3抗HSV-2活性结果

3.4 GH小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2的水平变化

3.4.1 美洲大蠊提取物CII-3对TNF-α的影响给药组的TNF-α水平与正常组和模型组比较均有所升高；ACV组，CII-3高、中剂量组与正常组和模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明CII-3能使小鼠血清中TNF-α的含量增加；CII-3高、中剂量组与ACV组比较差异没有统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 美洲大蠊提取物CII-3对TNF-α的影响（± s,n=12）

表5 美洲大蠊提取物CII-3对TNF-α的影响（± s,n=12）

注：与正常组比较*P＜0.05，与模型组比较▲P＜0.05，与ACV组比较★P＜0.05。

89.09±22.71★86.63±10.90★138.73±28.06*▲125.84±21.48*▲133.59±21.57*▲108.73±25.23★正常组模型组ACV组CII-3（高）CII-3（中）CII-3（低）— —10020010050

3.4.2 美洲大蠊提取物CII-3对IFN-γ的影响 与正常组比较，感染病毒后模型组小鼠血清中IFN-γ的水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；ACV组、CII-3组与正常组比较IFN-γ的水平亦显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），说明CII-3能使小鼠血清中IFN-γ的含量增加；CII-3中剂量组与ACV组比较，差异没有统计学意义（P＞0.05）。见表6。3.4.3 美洲大蠊提取物CII-3对IL-2的影响 与正常组比较，感染病毒后模型组小鼠血清中IL-2的水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；CII-3中剂量组与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05），说明CII-3中剂量组能够增加小鼠血清中IL-2的水平。模型组、CII-3低剂量组与ACV组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表7。

表6 美洲大蠊提取物CII-3对IFN-γ的影响（± s,n=12）

表6 美洲大蠊提取物CII-3对IFN-γ的影响（± s,n=12）

注：与正常组比较*P＜0.05，与模型组比较▲P＜0.05，与ACV组比较★P＜0.05。

44.31±11.07▲★99.91±19.62*★127.49±34.69*▲81.45±27.39*★109.16±37.17*81.40±21.90*★正常组模型组ACV组CII-3（高）CII-3（中）CII-3（低）— —10020010050

表7 美洲大蠊提取物CII-3对IL-2的影响（± s,n=12）

表7 美洲大蠊提取物CII-3对IL-2的影响（± s,n=12）

注：与正常组比*P＜0.05，与模型组比较▲P＜0.05，与ACV组比较★P＜0.05。

33.37±4.82▲23.64±1.58*★36.82±2.39▲38.30±3.72▲41.6±8.59*▲27.87±1.42*★正常组模型组ACV组CII-3（高）CII-3（中）CII-3（低）— —10020010050

3.5 美洲大蠊提取物CII-3对GH小鼠免疫器官指数的影响 感染病毒后模型组小鼠的胸腺指数和脾脏指数与正常组和ACV组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；CII-3高、中、低剂量组的胸腺指数与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；CII-3各剂量组的脾脏指数与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），CII-3高剂量组与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；说明CII-3能够增加小鼠的脏器指数。见表8。

表8 美洲大蠊提取物CII-3对小鼠胸脾指数的影响（±s,n=12）

表8 美洲大蠊提取物CII-3对小鼠胸脾指数的影响（±s,n=12）

注：与正常组比较*P＜0.05，与模型组比较▲P＜0.05，与ACV组比较★P＜0.05。

2.91±0.63▲1.83±0.11*★3.44±0.99▲4.06±1.28*▲3.54±1.04▲3.45±0.63▲正常组模型组ACV组CII-3（高）CII-3（中）CII-3（低）— —100200100503.09±0.80▲2.11±0.56*★3.17±0.69▲3.51±1.03▲3.37±0.63▲2.70±1.44

4 讨论

实验结果显示，美洲大蠊提取物CII-3随着给药浓度的增大，对正常Vero细胞的毒性逐渐增强，CII-3 的 TC50值 为 190.55 μg/mL。CII-3 有 抑 制HSV-2致细胞病变的作用，其IC50值为28.71 μg/mL，TI值为6.64 μg/mL。ACV对正常Vero细胞的细胞毒性很小，其TC50值＞100 μg/mL。ACV具有很好的抗HSV-2活性，其IC50值＜ 0.31 μg/mL，TI值大于322.58 μg/mL。美洲大蠊提取物CII-3有一定的细胞毒性，与低毒的ACV比较，TI值相距甚远。有文献报道，在细胞培养中用浓度为0.5%的DMSO溶解药物〔12〕，对细胞生长没有显著影响，而本次实验也证明了这一点。病毒感染人体后，可引起免疫反应，机体在抗HSV-2感染中主要依赖于细胞免疫反应。Th1是CD4+T细胞中的一类亚群，主要分泌TNF-α、IFN-γ和IL-2等细胞因子，从而介导细胞免疫〔13〕。TNF-α在体内具有广泛的生物学活性，它是免疫应答中的一种中间介质，有着抗病毒作用。IFN-γ能激活T细胞、巨噬细胞、NK细胞活性及增加它们对病毒感染细胞的杀伤力。IL-2是一种比较重要的淋巴因子，其主要生物学活性是促进T淋巴细胞和NK细胞的增殖以及促进B细胞分化和增殖，并促进抗体的生成〔14-15〕。胸腺和脾脏是机体的免疫器官，其中胸腺是首要的中枢免疫器官，脾脏是最大的外周免疫器官，它们在免疫系统中均发挥着重要作用。实验结果显示，美洲大蠊提取物CII-3能够提高小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2的水平，还能使小鼠的免疫器官重量增加。上述研究结果表明，美洲大蠊提取物CII-3有抗HSV-2作用，分析其可能是通过提高机体免疫功能而发挥抗病毒作用，具有良好的应用前景。

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