雌激素样化合物对人细胞色素氧化酶2A6基因的转录调控

黄春玲，邓 寒，柯雪娥，韩霜雪，何晓阳

（深圳大学生命科学学院1．深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，2．深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳518060）

雌激素样化合物对人细胞色素氧化酶2A6基因的转录调控

黄春玲1，邓 寒1，柯雪娥2，韩霜雪2，何晓阳1

（深圳大学生命科学学院1．深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，2．深圳市微生物基因工程重点实验室，广东深圳518060）

目的建立尼古丁代谢酶CYP2A6报告基因高容量筛选系统，分析环境和天然雌激素样化合物对CYP2A6基因转录的影响。方法构建3种CYP2A6基因转录上游－2460～＋1全长、增强子-启动子串联和3倍增强子-启动子串联的荧光素酶报告基因重组体pGL3-2A6 3UP，GL3-2A6 EP和pGL3-2A6 3EP，分别与雌激素受体α（ERα）及海肾荧光蛋白表达载体三重共转染人肝HepG2细胞。用双荧光素酶报告基因分析技术，选择确认对雌二醇诱导应答最强的CYP2A6报告基因系统；分别用氰戊菊酯、2，2′，4，4′-四溴联苯醚、4-二羟基二苯基丙烷、全氟辛酸铵、淫羊藿苷、大豆苷元和槲皮素等7种拟雌激素化合物处理转染报告基因的HepG2细胞，同时设置雌二醇10 nmol·L－1阳性和0．1%DMSO阴性对照，48 h后测定各组细胞相对荧光强度，分析评估拟雌激素物质对CYP2A6基因转录的诱导作用。结果3种CYP2A6报告基因重组体中pGL3-2A6 3EP对雌二醇诱导应答最强，且呈显著量效依赖关系。7种拟雌激素化合物对CYP2A6报告基因均具显著诱导作用，其中，2，2′，4，4′-四溴联苯醚1．0～100．0 nm ol·L－1诱导倍变值为1．45±0．13～3．30±0．13（P＜0．01），诱导效应最强。表现出相似的量效诱导关系，淫羊藿苷、大豆苷元和槲皮素10μmol·L－1时的诱导倍变值为2．41～2．83（P＜0．01）。结论建立灵敏可靠、重复性强的CYP2A6报告基因高容量筛选系统，证实多种拟雌激素物质通过激活ERα诱导CYP2A6报告基因转录。提示环境拟雌激素污染物和药材食材雌激素样活性物质可诱导个体尼古丁代谢酶基因表达，从而干扰个体尼古丁代谢清除活性及其对环境化合物致癌代谢活化水平。

细胞色素P450 CYP2A6；转录水平调控；拟雌激素化合物

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2013．06．014

肝的细胞色素氧化酶2A6（cytochrome P450 2A6，CYP2A6）是人体主要的尼古丁代谢酶，承担＞80%尼古丁的代谢清除。此外，它还可催化尼古丁与4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶）-1-丁酮〔4-（methylnitrosamino）-1-（3-pyridyl）-1-butanone，NNK）之间的生物转化［1］，并可致癌代谢活化NNK、微生物污染物黄曲霉素（aflatoxin B1，AFB1）等多种环境致癌原［2－3］。CYP2A6的这种双重代谢作用，使其成为评估个体尼古丁耐受成瘾、吸烟行为以及环境暴露与癌症易感性关系的重要生物学标志。分子流行病学研究显示，个体尼古丁酶代谢活性具有显著性别差异，尼古丁快代谢人群一般对烟草及环境致癌原物质的致癌代谢活化水平增大，罹癌风险增高［3］。女性尼古丁代谢清除速率一般比男性高，且口服含有雌激素避孕药的女性和孕期妇女，其尼古丁清除明显加快，CYP2A6肝外组织表达水平在乳腺和卵巢中较高［4－5］。提示CYP2A6基因表达可能受到性激素调控。近年来研究发现，在具有雌激素受体α（estrogen receptor-α，ERα）的乳腺癌MCF7细胞中，包括CYP2A6在内的一些致癌原活化代谢基因的表达显著上调，而ERα阴性的乳腺癌细胞则无明显改变［4］。日本学者在2007年发现，CYP2A6基因转录上游调控序列－2500～－2300区间存在与保守的雌激素反应元件（estrogen response elem ent，ERE）高度同源的序列（简称为ERE-like），并证实雌二醇（estradiol，E2）通过核受体ERα介导而明显上调CYP2A6基因转录［6］。

我国主动吸烟人口有3亿，被动吸烟人口5亿，且被动吸烟人口以妇女和儿童为主，而我国又同时是拟除虫菊酯类农药、塑料制品及家用电器生产使用大国，存在着比较广泛的环境拟雌激素化合物残留，常见的包括杀虫农药氰戊菊酯（fenvalerate，FEN）、电器阻燃剂2，2′，4，4′-四溴联苯醚（2，2′，4，4′-tetrabromodiphenyl ether，BDE-47）、塑料添加剂4-二羟基二苯基丙烷（又称双酚A，bisphenol A，BPA）和全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）等。这些拟雌激素物质在土壤、水源及果蔬中的残留超标情况十分普遍，其低剂量、长时间暴露是普通人群的一个重要特征［7－9］。此外，我国保有自行食补和药补的生活习惯，食物和中草药材中常含有的一些天然活性成分如大豆苷元（daidzein，DAI）、槲皮素（quercetin，QUE）和淫羊藿苷（icariin，ICA）都被证明具有雌激素样生物活性。因此，研究我国常见环境拟雌激素和植物源雌激素样活性物质对CYP2A6基因表达的影响及其分子机制，对于阐明吸烟相关环境、基因与罹癌风险关系具有重要理论与实践意义。因此，本研究旨在通过建立灵敏可靠和重复性强的CYP2A6报告基因高容量筛选系统，以E2为阳性对照，分析评估上述7种雌激素样化合物对人CYP2A6基因转录调控的影响，并探索其分子机制，为国家控烟和评价环境污染与健康风险等公共卫生领域重大问题提供科学依据。

1 材料与方法

1．1 试剂和仪器

荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic、海肾红色荧光蛋白表达质粒pRL-TK（内参）和双荧光素酶报告系统试剂盒均质购自Promega公司；pcDNA3．0-ERα质粒由南开大学生命科学学院张琚教授馈赠。Lipofectamine2000和PlatinumⓇTaq DNA聚合酶购自美国Invitrogen公司。人肝癌细胞株HepG2（ATCC-HB-8065，Manassas，美国）细胞来自深圳市疾病预防控制中心。E2，FEN，BDE-47，BPA和PFOA购自Sigm a公司；ICA，DAI和QUE购自中国药品生物制品检定所。化学发光仪购自赛默飞（中国）公司。

1．2CYP2A6报告基因重组体构建

根据GenBank人CYP2A6基因序列（NG＿000008．5）设计引物，并引入需要的酶切位点，由深圳华大基因公司合成。扩增上游－2460～＋1全长序列的引物对为2A6-2500 F：5′-CTCGAGGGTGGTAGTGGGATGATAGA-3′，2A6-2500 R：5′-AAGCTTTCATTGACCTCTATGTCCACAAAT-3′；扩增－2460～－2363含ERE同源序列的增强子片段引物对为2A6-E F：5′-CTCGAGGGTGGTAGTGGGATGATAGA-3′，2A6-E R：5′-GGATCCGAGGCCCCCTCTCTGTTC-3′；扩增－205～＋1启动子序列引物对为2A6-P F：5′-AGATCTTGTTTCTCACTGGGGTTGG-3′，2A6-P R：5′-AAGCTTTCATTGACCTCTATGTCCACAAAT-3′。以人肝细胞染色体DNA为模板，用PlatinumⓇTaq DNA聚合酶进行PCR，特异性地扩增CYP2A6基因上游约2500 bp序列全长。PCR条件为94℃3 m in活化后，94℃变性30 s、64℃退火30 s、72℃延伸2．5 m in，循环30次，72℃延伸10 m in。用pMDⓇ20-T载体，按产品说明书操作，保存、中转PCR扩增产物并测序确认序列完全与GenBank收载序列一致。利用HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，将目的基因插入pGL3-Basic载体，构建成CYP2A6基因转录上游全序列报告基因重组体pGL3-2A6 UP。以pGL3-2A6UP-Luc质粒为模板，分别PCR扩增增强子和启动子序列，并构建增强子-启动子串联的CYP2A6报告子pGL3-2A6EP重组载体，测序确认序列正确；进一步通过酶切位点的拼接，构建成3×ERE-启动子串联的报告子pGL3-2A6 3EP。

1．3 细胞培养、三重重组质粒共转染HepG细胞与雌二醇诱导

提前24 h以每孔0．05×106HepG2细胞的密度接种于24孔细胞培养板，用含10%FBS的RPM I 1640完全培养基，5%CO2，37℃条件常规培养。待细胞汇合度为60%～70%时，用Lipofectamine 2000按产品使用指南操作，介导报告子、核受体和内参质粒的三重共转染。CYP2A6报告子pGL3-2A6 UP，pGL3-2A6EP和pGL3-2A6 3EP分别与PCDNA3．0-ERα和PRL-TK三重共转染HepG2细胞24 h后，用含E210 nmol·L－1的完全培养液置换旧培养液，常规条件下培养细胞，24 h时换新鲜E2培养液1次，培养至48 h。平行设置含0．1%DMSO常规培养液处理的阴性对照组。

1．4 细胞裂解液相对荧光强度测定

上述共转染报告基因并进行诱导处理后的HepG2细胞，吸弃上层培养液，用PBS洗涤3次，按照Promega公司的Dual-Luciferase Reporter 1000 Assay System试剂盒使用说明书，每孔加入1×PLB细胞裂解液100μL，室温下充分裂解。裂解液用化学发光仪分别测定萤火虫荧光素酶的黄色荧光强度和海肾荧光素酶的红色荧光强度，并以后者为内参进行归一化处理，以样品相对荧光强度表示各样品CYP2A6启动子转录活性。

1．5 细胞转染条件优化

选择对E2诱导应答最强的报告基因，按1．4所述方法，在24孔培养板上，按照每孔0．05×106细胞转染报告子、核受体和内参质粒DNA分别为：50／0／2 ng，20／20／2 ng，40／10／2ng，30／30／2 ng，40／20／2 ng和40／40／2 ng 6种不同浓度和比例，进行三重重组体共转染HepG2细胞，24 h后再用E210 nmol·L－1处理细胞48 h，测定细胞裂解液相对荧光强度，确认对E2诱导响应最强的转染条件为最适转染条件，并保持在该转染条件下，检测CYP2A6报告基因分析体系对E20～10 nmol·L－1处理的诱导应答量效关系；进一步分析7种拟雌激素的诱导效应。

1．6 拟雌激素化合物对CYP2A6报告基因的诱导作用

分别用含BDE-47 0．1，10．0和100．0 nmol·L－1，FEN 0．05，0．5和5．0μm o l·L－1，BPA或PFOA 1．0，10．0和100．0μm o l·L－1，以及DAI或QUE或ICA 0．01，0．1，1．0和10．0μmol·L－1的完全培养液处理转染CYP2A6报告基因的HepG2细胞48 h，按前文所述方法测定各种处理条件下细胞裂解液样品的相对荧光强度。平行设置0．1%DMSO处理细胞为阴性对照，E210 nmol·L－1处理细胞为阳性对照。

以上所有细胞转染及其诱导实验均重复3次，独立操作，每次实验均平行设置3个复孔。

1．7 统计学分析

2 结果

2．1 三种CYP2A6荧光素酶报告基因重组体构建

以人肝细胞染色体DNA为模板，用CYP2A6 UP F／R引物和高保真DNA聚合酶，PCR特异性扩增出约2500 bp长度的目的基因条带，1%凝胶电泳检测如图1A所示。将该PCR产物连接于pMDⓇ20-T载体并转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆测序，确认获得序列正确的目的DNA片段。在此基础上分别用2A6E-F／R引物和2A6PF／R引物，PCR扩增获得含ERE-like、～150 bp增强子序列和～200 bp启动子序列，2%凝胶电泳检查结果见图1B，经过T-载体中转、测序正确。亚克隆分别将CYP2A6基因上游序列全长、5′→3′顺序增强子-启动子串联体和3×增强子-启动子串联体连接进入pGL3-pGL3-Basic表达载体。转化大肠杆菌感受态细胞，挑选培养阳性克隆，提取质粒DNA，用HindⅢ和XhoⅠ进行双酶切消化，凝胶电泳检测结果如图2所示，3种质粒酶切后分别释放出～2500 bp，～400 bp和～600 bp的插入片段及～5000 bp的载体片段，长度符合预期，表明3种报告基因重组体均构建成功，分别命名为pGL3-2A6 UP，pGL3-2A6 EP和pGL3-2A6 3EP，用于后续研究。

Fig．1 Electrophoresis analysis of PCR products of CYP2A6 gene 5′-franking region．A：M，DL5000 marker；lane 1，CYP2A6 gene upstream－2460～＋1 sequence．B：M，DL2000 marker；lanes 1－2，CYP2A6 gene potential enhancer region－2363～－2460 sequence，which containing the estrogen response element（ERE）；lanes 3－4，CYP2A6 gene－205～＋1 promoter sequence．

2．2 三种报告基因对雌二醇的诱导应答

图3结果显示，各报告基因均对E2显示出诱导应答，相较DMSO处理细胞，诱导倍数在1．5～4倍范围。但比较相对荧光强度可见，全序列的pGL3-2A6 UP对E2诱导响应最低，pGL3-2A6 EP次之，pGL3-2A6 3EP最高。说明自然状态的CYP2A6基因转录调控序列在体外可呈现对雌激素的诱导应答，但是强度较低，不宜作为筛选评估拟雌激素诱导作用的分析系统。删除增强子与启动子之间可能的衰减子序列或增加ERE-like元件的数目，均可以增强CYP2A6报告基因体系对雌激素的诱导应答。因此，本研究选择诱导应答最强的pGL3-2A6 3EP报告子，用于后续转染条件优化和建构高容量筛选体系的研究，并进一步评估拟雌激素物质对CYP2A6基因转录调控的影响。

Fig．3 Relative trancriptional activities of three CYP2A6 luciferase reporter constructs under estradiol treatment and co-expression of estrogen receptor-α（ERα）in HepG2 cells．Schematic representation of the luciferase reporter constructs is on the left．Reporter construct containing the CYP2A6 gene－2460～＋1 region（pGL3-2A6 UP），or the potential enhancer region host estrogen response elem ent（ERE）-like tandem in the 5′of promoter（pGL3-2A6 EP），or three copies of this ERE-like tandem in the 5′of promoter（pGL3－2A6 3EP），was transfected into HepG2 cells with pcDNA3．0-ERαand pRL-TK．After 24 h，the cells were treated with estradiol E210 nmol·L－1or 0．1%DMSO for 48 h．Activities of firefly luciferase in cell lysates were normalized to those of cotransfected Renilla reniformis（RR）luciferase．，n＝3．**P＜0．01，compared with DMSO treatment．

2．3 最适细胞转染条件的筛选

E2对CYP2A6基因转录的诱导作用，已确认为通过结合于细胞质中的ERα使之发生构象改变和核位移，形成同二聚体结合于基因上游转录调控区域中ERE元件同源序列而上调CYP2A6基因转录水平［8］。建立可以实际应用的CYP2A6报告基因高容量筛选体系，必须灵敏、稳定和重现性好。因此，需要考察细胞共转染报告子与核受体ERα的最适浓度与比例，以获得对诱导剂稳定和高效的诱导应答。实验结果显示（图4），CYP2A6报告基因与核受体ERαDNA的转染浓度与比例极大地影响报告基因体系对E2的诱导应答强度。当报告子与核受体DNA转染的用量与比例为50 ng∶0 ng时，E2诱导转基因细胞的相对荧光强度值较小，诱导倍变值亦最低，仅为DMSO对照组的1．5倍左右，表明细胞内源性ERα不足以灵敏介导雌激素的基因转录诱导效应。而共转染CYP2A 6报告子和核受体ER重组DNA时，报告基因体系的诱导倍变值均明显提升至2倍以上。其中，转染重组 DNA pGL3-2A6 3EP∶pCDNA3．0-ERα为40 ng∶20 ng时，转基因细胞对E2的诱导应答灵敏且稳定，各次实验的相对荧光值均在10～100范围，诱导倍变值则稳定在3～4倍范围，重现性良好。因此，确认该转染浓度和比例为最适报告基因转染条件，并在此转染条件下进行后续拟雌激素诱导实验。

Fig．4 Effect of reporter／receptor DNA transfection concentration on induction response in CYP2A6 reporter luciferase activity．Different concentrations of reporter plasmid pGL3-2A6 3EP were transfected into HepG2 cells with or without ERαexpression for 24 h and then treated with E210 nmo·lL－1for 48 h．Relative luciferase activities and fold induction data represent three independent experiments．1－6：Reporter∶receptors were 50 ng∶0 ng，20 ng∶20 ng，40 ng∶10 ng，30 ng∶30 ng，40 ng∶20 ng and 40 ng∶40 ng，respectively．，n＝3．*P＜0．05，**P＜0．01，compared with DMSO treatment．

2．4 pGL3-2A6 3EP报告基因分析系统对雌二醇诱导应答的量效关系

表1结果表明，在E20～10 nmol·L－1浓度范围对CYP2A6报告基因转录具有显著的量-效依赖性诱导作用，E210 nm o l·L－1处理细胞的转录活性是DMSO处理细胞的（3．91±0．36）倍。该结果与前述转染条件优化项下结果一致，进一步证实优化转染条件下，CYP2A6双荧光素酶报告基因分析系统可应用于研究评估拟雌激素化合物对CYP2A6基因转录的影响。

Tab．1 Concentration-dependent induction response of CYP2A6 reporter gene to E2treatment

2．5 环境拟雌激素对CYP2A6转录的诱导作用

4种环境拟雌激素BDE-47，BPA，PFOA和FEN在本研究浓度范围，对CYP2A6报告基因均具有明显的诱导作用（表2）。CYP2A6报告基因系统对各种拟雌激素化合物的诱导应答强度随浓度从低到高而依次增大，具有显著的浓度依赖性。在环境化合物中，BDE-47对CYP2A6转录诱导效应最强，浓度为100．0 nmol·L－1时，诱导倍变值达到3．30±0．13（P＜0．01），几乎与阳性对照E210 nmo l·L－1的诱导效应持平；BPA在1～100μm o l·L－1浓度范围，诱导CYP2A6报告基因的效应亦稳定上升，在100μmol·L－1时，诱导倍变值达到1．85±0．15（P＜0．01）；PFOA和FEN总体表现出较弱的诱导效应，各实验浓度下上调50%左右。需要提及的是，FEN在10μmo l·L－1浓度时表现一定细胞毒性，镜检可见少量细胞悬浮，因而调整最高浓度为5μmol·L－1，此条件下未见细胞有显著死亡，但亦未见诱导作用增加。

Tab．2 Concentration-dependent induction of environmental estrogenic compounds on CYP2A6 transcription

2．6 植物拟雌激素对CYP2A6转录的诱导作用

Fig．5 lnduction effects of phytoestrogen treatment on CYP2A6 reporter gene luciferase activities．HepG2 cells trancently co-expressing CYP2A6 luciferase reporter gene and ERαwere harvested after phytoestrogen for 48 h．E210 nmol·L－1was used as the positive control．ICA：icarrin；DAI：daidzein；QUE：quercetin．，n＝3．**P＜0．01，compared with 0．1%DMSO treatment（0μmol·L－1）．

3种天然雌激素样活性物质ICA，DAI和QUE在0～10μmol·L－1范围内均表现相似的浓度依赖性CYP2A6报告基因诱导作用（图5）：在0．1μmo l·L－1浓度，开始表现出明显的转录诱导效应（提高接近200%），而10μm ol·L－1时，诱导CYP2A6报告基因相对荧光强度上升2．41～2．83倍（P＜0．01）。提示环境化合物和天然雌激素样活性物质可能对人体尼古丁代谢酶基因转录产生干扰作用，但其产生效应浓度远较E2高，有必要进一步进行深入细致的研究。

3 讨论

CYP2A6表达的组织特异性、个体酶活性的性别差异以及癌变组织中表达改变等，无不表明其基因表达除受到基因多态性的遗传因素影响外，还受到生理状况、生活习惯和环境暴露等多种因素的影响［10－11］。虽然自2005年以来，有关CYP2A6基因表达调控的研究报道开始增多，但目前人们对相关的影响因素及其分子机制仍然知之甚少。

重要的肝CYP家族药物代谢酶基因转录除受到肝细胞核因子4α（hepatic nuclear factor 4 alpha，HNF-4α）调控外，还主要受到几种核受体调控，如利福平和苯巴比妥等药物主要通过孕烷X受体（pregnane X-recep tor，PXR）介导而显著诱导CYP3A4等基因转录；一些神经系统药物及环境化合物二噁英、三甲胆蒽和萘酚等均可激活芳烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）而上调CYP1A1，1A2，和1B1等基因转录；苯巴比妥、CITCO｛6-（4-chlorophenyl）imidazo［2，1-b］［1，3］thiazole-5-carbaldehyde-O-（3，4-dichlorobenzyl）oxime｝则可以激活组成型雄烷受体（constitutive androstane receptor，CAR）而诱导CYP2B亚家族基因转录等。然而，上述通用核因子对CYP2A6基因转录的调控作用却并不明显。目前已证实，CYP2A6基因转录区上游－205～＋1 bp为核心启动子序列，存在TATA盒、C／EBP及HNF-4α应答元件、CCAAT盒等重要调控元件［12］。近年来研究发现，利福平亦可诱导原代肝细胞CYP2A6 mRNA水平增高，并确认CYP2A6基因转录上游远端约－7000～－4600 bp区域存在同向结合模序DR4相似序列（DR4-like），可与CAR和PXR等结合，但只有当PXR与过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子-1α（p ro liferator-activated receptorγ coactivator1α，PGC1）共过表达时，利福平才能显著诱导CYP2A6报告基因转录活性约4倍［13］。地塞米松也可诱导肝细胞CYP2A6基因表达，其机制为结合于糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）后入核，通过增强HNF-4α与其启动子区域的HNF-4α结合元件的结合，从而上调基因转录水平［14］。2011年，Naka jim a等［15］报道，溶血栓及抗氧化药物萝卜硫素（sulforaphane，SFN）可以激活核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2），与－1193～－1212 bp区域的抗氧化反应元件（antioxidant response element 1，ARE1）结合，诱导CYP2A6 mRNA表达1．4倍，但香豆素代谢酶活性却增加1．9倍，提示机体或细胞的氧化应激状态可影响CYP2A6基因表达。此后的研究报道证实，乙醇经CYP2E1代谢而导致细胞氧化应激，可激活Nrf2因子，入核后经蛋白激酶C／丝裂原活化蛋白激酶激酶通路（protein kinase C／mitogen-activated protein kinase kinase，PKC／MEKK）而诱导U937单核细胞中CYP2A6基因转录提高200%［16］。分析比较上述研究结果不难发现，原代人肝细胞或一些细胞系中的CYP2A6转录受到许多药物和化合物的影响，但诱导水平却有限，表现出诱导物较多但诱导效应均不高（大多在1．5～3倍之间）以及多重因素综合效应较为明显等基因转录调控总体特征。本研究结果显示，7种拟雌激素化合物都可以不同程度地上调CYP2A6基因转录活性，诱导作用肯定但报告基因诱导倍数基本＜3倍，再次证实了这一特征。

Higashi等［6］发现，在原代肝细胞和ER高表达的乳腺MCF-7细胞中，CYP2A6基因转录受E2诱导上调～50%，而在ER阴性的MDA-MB-435细胞中则不受影响。免疫组化研究结果显示，性成熟女性子宫内膜腺上皮细胞中CYP2A6免疫阳性反应强度与生理周期相关，增殖期和早期分泌期CYP2A6水平明显较晚期分泌期为高。进一步的研究证实，E2激活ERα入核，结合于CYP2A6基因上游－2500～－2363 bp区域内ERE同源序列，从而诱导CYP2A6基因转录。该研究表明，CYP2A6可直接以ERα依赖性方式被诱导，揭示了CYP2A6在雌激素应答组织中特异性表达的重要原因。本研究首先是建立肝HepG2细胞／CYP2A6报告基因体系，通过优化转染条件，使之成为能规范化操作、重复性好和可常规性应用于大量化合物筛选评估的高容量分析系统。应用该体系对以BDE-47和DAI为代表的7种拟雌激素化合物进行探索的结果证实，这些拟雌激素物质在实验浓度范围对CYP2A6报告基因均有转录诱导作用，但效果不一，其中最引人瞩目的是BED-47。在BED-47 10 nm o l·L－1时，其对CYP2A6报告基因的诱导倍数约2倍，达到相同浓度E2诱导强度的50%；而当其浓度为100 nmo l·L－1时，诱导效应与E2基本持平。BDE-47是多溴联苯醚化合物（polybrominated diphenyl ethers，PBDE）的成员之一。PBDE常被用作阻燃剂添加到塑料、橡胶制品、建筑材料和纺织品等各种潜在可燃材料以及电子电器产品中，它们可通过从基质释放和废旧材料的回收处理等过程污染环境，因其在环境中难降解和具有亲脂憎水性，持久性和生物富集成为PBDE的主要环境污染特征。尽管自2009年起，斯德哥尔摩公约将五溴和八溴联苯醚列为新型持久性有机污染物加以管制，世界各国陆续禁止其生产和使用，但在生物样品和人体组织中检测到的PBDE水平仍在不断上升。我国广东贵屿、清远和浙江台州等大型电器垃圾拆解场及其周边环境以及珠江三角洲和长江三角洲等经济发达地区空气、土壤、水体、沉积物、污水处理厂污泥、生物体和人体中PBDE的水平相当高，长江下游水生生物和广东清远地区的田螺、虾、鱼和水蛇等生物体中PBDE污染较为严重，主要有BDE-47，BDE-100和BDE-154在淡水食物链中呈现了生物放大效应［6，17－18］。我国普通人群母乳中PBDE含量在800～11000 pg·g－1脂重之间，平均水平低于欧美发达国家（可能与饮食中动物食品相对较少有关），但PBDE153，47和28是检出浓度最高的主要特征组分［19］。可以认为，进入环境中的BDE-47，即便极其微量，由于其极强的长距离传输能力和生物放大作用，也会在处于食物链高位的生物体内大量富集，可能引起较为严重的内分泌干扰等生理效应。本研究结果不仅跟进证实雌激素和拟雌激素均通过激活ERα作用于基因上游ERE元件而诱导CYP2A6转录，更为重要的是对于探索环境中内分泌干扰物污染与人体尼古丁代谢活性及NNK和AFB1等环境致癌原的致癌代谢活化关系提供了有先导性意义的实验数据。

另一方面，本研究检验的三种食材药材雌激素样物质亦对CYP2A6表现出较强的诱导作用，量效关系基本一致。DAI 0．01～10μm o l·L－1对CYP2A6报告基因的诱导实验结果和Du等［20］报道的植物雌激素样物质诱导ER／ERE介导的基因转录的实验数据高度一致，对CYP2A6报告基因诱导效应最为稳定。DAI主要来源有大豆、紫苜蓿和葛根等，常常在临床或食补中用于替补防止骨质疏松和辅助防治前列腺癌等。QUE是具有广泛来源的植物类黄酮，也是银杏总黄酮醇苷的苷元之一，作为药品祛痰、止咳、平喘作用和辅助治疗冠心病及高血压等。ICA在传统补肾强体基础上广泛应用于增强免疫功能、抗骨质疏松、治疗心脑血管疾病，近年来更扩展至研究其中枢神经系统药理作用，应用于阿尔茨海默病的干预治疗［21］。因此，我国普通民众中因食物习惯和中药保健调理及治疗等具有相当复杂多变的植物雌激素样物质摄入范式。本研究初步揭示，这些植物雌激素样物质对CYP2A6报告基因具有十分肯定的诱导作用，进一步的细胞和整体水平的验证则需要后续工作的深入研究。

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（本文编辑：付良青）

《中国药理学与毒理学杂志》中图片要求

论文中的各种图片包括病理照片图、曲线图、柱图、电泳图及化学结构式图等，应按以下要求处理。

1．病理照片图应采用加标尺的方式表示，并在图中配上箭头指示病变区域（图1，图4）。除照片图外，其他图均用灰度图表示。曲线图图例依次为○●△▲□■等，图例字号为6磅字体为Arial。图中统计学分析符号标注依次为*＃△等。

2．双栏图大小为：宽与高的比为3∶2，宽≤7．5 cm，横、纵坐标的字号为8或9磅字体为Arial；条带图上标注为：M，1，2，3，4，5等。

3．通栏图大小为：宽≤15 cm。字号为9或8榜。横、纵坐标的字号为8或9磅字体为Aria l。

4．其他有关图表自明的要求见本刊网站http：／／www．cjpt．ac．cn下载中心的投稿须知中的第19条和论文模版中的举例。

lnduction of human cytochrome P450 2A6 transcription by estrogen ic com pounds

HUANG Chun-ling1，DENG Han1，KE Xue-e2，HAN Shuang-xue2，HE Xiao-yang1
（1．Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresources and Eco logy，2．Shenzhen Key Laboratory of Microbia l Genetic Engineering，College of Life Sciences，Shenzhen University，Shenzhen 518060，China）

OBJECTlVETo develop a CYP2A6 gene transcriptional high-capacity screening system and to evaluate the regulatory effects of four environmental estrogenic compounds and three phytoestrogens on CYP2A6 gene transcription．METHODSThree luciferase reporter plasm ids containing the CYP2A6 gene－2460～＋1 5′-flanking region（pGL3-2A6 UP），the potential enhancer region host estrogen response element（ERE）-like tandem in the 5′of promoter（pGL3-2A6 EP），and three copies of this ERE-like tandem in the 5′o f promoter（pGL3-2A6 3EP）were constructed．Each reporter plasmid DNA was co-transfected into HepG2 cells with receptor pcDNA3．0-ERαand pRL-TK．Dual-luciferase assay was performed after 48 h treatment by different estrogenic com pounds，including four environmental pollutants 2，2′，4，4′-tetrabromodiphenyl ether（BDE-47），bisphenol（ABPA），fenvalerate（FEN），perfluorooctanoic acid（PFOA）and three phytoestogens icariin（ICA），daidzein（DAI）and quercetin（QUE），as well as 0．1%DMSO（negative control）and 10 nmol·L－1estradiol（positive control）．RESULTSpGL3-2A6 3EP reporter construct rep resented the strongest concentration-dependent induction response to the estradiol treatment．CYP2A6 transcription activity was significantly up-regulated by all the seven estrogenic compounds．Among these chemicals，BDE-47 was of particular interest with remarkable induction fold changes from 1．45±0．13 to 3．30±0．13（P＜0．01）corresponding to concentrations ranging from 1．0 to 100 nmol·L－1．Phytoestrogens ICA，DAI and QUE represented a similar concentrationinduction pattern．241%to 283%increases compared with DMSO control in CYP2A6 promoter activity were observed under phytoestrogens 10μm ol·L－1treatment．CONCLUSlONCYP2A6 promoter activity is induced by estrogen and estrogenic compounds in an estrogen receptor-dependent manner，implying the biological effects of common environmental endocrine disrupting the chemicals′regulation of CYP2A6 gene transcription in the hum an body．Furthermore，this mechanism can also explore individual nicotine metabolism and carcinogenic susceptibility under hazardous and estrogen-rich environments．

cytochrome P-450 CYP2A6；transcriptional-level control；estrogenic compounds

HE Xiao-yang，E-mail：hexy2008＠szu．edu．cn，Tel：（0755）26538722

R977．1

A

1000-3002（2013）06-0088-09

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（31070731）；and National Natural Science Foundation of China（21271131）

2013-07-16 接受日期：2013-09-25）

国家自然科学基金（31070731）；国家自然科学基金（21271131）

黄春玲，女，硕士研究生，主要从事环境毒理学研究。

何晓阳，E-mail：hexy2008＠szu．edu．cn，Tel：（0755）26538722