白介素33对乳鼠心肌细胞乏氧/复氧损伤时胞内活性氧自由基生成的影响

李冠臻 张新超

.基础研究.

白介素33对乳鼠心肌细胞乏氧/复氧损伤时胞内活性氧自由基生成的影响

李冠臻 张新超

目的 探讨白介素33(IL-33)对乳鼠心肌细胞乏氧/复氧损伤的保护作用及胞内活性氧自由基(ROS)生成的影响。方法 分离培养SD乳鼠心肌细胞，将原代培养的心肌细胞随机分为单纯对照(C)组、加药对照(rIL-33 100 ng/ml，C1)组、乏氧/复氧(A/R)组、A/R+rIL-33(1、10、100 ng/m l)组，乏氧培养3 h后，复氧2 h。免疫组化鉴定心肌细胞；MTT法检测细胞存活率；ELISA试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率；流式细胞仪检测细胞凋亡(AV-PI双标法)、胞内ROS生成量(ROS-DHE荧光探针)。结果 与C组相比，A/R组心肌细胞存活率明显下降(P＜0.01)，LDH漏出显著增高(P＜0.01)，凋亡率及胞内ROS含量显著增加(P＜0.01)；与A/R组相比，IL-33治疗组剂量依赖性地提高细胞存活率(P＜0.01)，降低LDH漏出率、细胞凋亡率(P＜0.01)及胞内ROS含量(P =0.03)；加药对照组与C组相比，心肌细胞存活率、凋亡率、胞内ROS含量差异无统计学意义。结论IL-33在心肌乏氧/复氧损伤过程中可以剂量依赖性地发挥抗细胞凋亡作用，其保护作用机制可能与增强心肌抗氧化能力，减少胞内ROS生成有关。

白细胞介素33； 活性氧； 肌细胞；心脏； 乏氧/复氧损伤

【Key words】Interleukin-33； Reactive oxygen species； Myocytes，cardiac； Anoxia/ reoxygenation-induced injury

近年研究显示，重组白介素33(IL-33)可以对抗压力过载导致的心功能障碍［1］，在动物心肌梗死模型、心脏、肝脏缺血/再灌注模型及体外心肌细胞A/R模型中发挥细胞保护作用，其机制可能是通过激活核转录因子(NF)-κB，抑制血管紧张素Ⅱ及PKCβ/JNK通路［2-5］。在乏氧/复氧诱导的心肌凋亡过程中IL-33对胞内活性氧自由基(ROS)的影响，目前未见相关报道。本研究拟探讨IL-33对抗体外培养的乳鼠心肌细胞乏氧/复氧模型细胞凋亡、提高存活率的分子机制。

1 材料和方法

1.1 乳鼠心肌细胞培养

健康1～3 d龄(雌雄不拘)SD乳鼠购于斯贝福(北京)实验动物科技有限公司。无菌条件下取心室肌，去钙HBSS液(Gibco)漂洗残血后，剪碎至1～2 mm3组织块，用0.08%胰蛋白酶+0.03%Ⅱ型胶原酶(Gibco)37℃恒温振荡消化。收集除第一次外的细胞悬液，加入等体积预冷的含10%FBS (Hyclone)的DMEM培养液(Gibco)终止消化。4℃，1200 r/min离心10 min，弃上清。收集沉淀加入含20%FBS的DMEM培养基重悬细胞，经200目细胞筛过滤去除组织块，接种于50 ml培养瓶中。差速贴壁法(2 h)分离纯化心肌细胞，24 h后换液，72 h后换无血清DMEM培养基同步化12 h备用。

1.2 心肌细胞乏氧/复氧模型的建立

乏氧/复氧模型的建立方法参照文献［6］，将同步化12 h的心肌细胞弃掉原培养液，加入高浓度N2(99.9%，30 min)饱和的无血清DMEM培养液，放入低氧培养箱(SANYO MCO-18M)通入1%O2、5% CO2、94%N2，乏氧培养3 h后，更换含20%FBS的DMEM培养基，放入正常培养箱(95%空气，5% CO2)中复氧2 h。

1.3 实验分组

参照文献［2，7］，将原代培养的乳鼠心肌细胞随机分为6组:单纯对照(C)组、加药对照(rIL-33 100 ng/m l)组、乏氧/复氧(A/R)组、A/R +rIL-33(1、10、100 ng/m l)组:A/R处理前30 min加入rIL-33(北京义翘神州生物技术有限公司Sino Biological Inc)。

1.4 心肌细胞鉴定

将培养48 h，搏动良好的心肌细胞甲醇固定后，用小鼠单克隆抗α-横纹肌肌动蛋白抗体(1∶100，α-SCA，武汉博士德生物工程有限公司)室温孵育过夜，二抗用兔抗小鼠IgG(1∶5000，武汉博士德生物工程有限公司)孵育。心肌细胞α-SCA抗原表达阳性，胞浆呈棕黄色颗粒，胞核呈蓝紫色。镜下任选10个视野，计数200个细胞，计算阳性率。

1.5 心肌细胞存活率测定

用过滤除菌的PBS(Gibco)溶解MTT(北京鼎国生物技术发展有限公司)，终浓度0.5 mg/ml，参照试剂说明书，通过酶标仪测定490 nm吸光度值，计算心肌细胞存活率。

1.6 心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测

参照大鼠LDH检测试剂盒(北京瑞尔欣德科技有限公司)说明书，复氧2 h后收集各组细胞培养上清液，4℃离心20 min(3000 r/min)后加入抗体包被的酶标板中(10 μl/孔)，充分反应后用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值，通过标准曲线计算样品中大鼠LDH浓度。

1.7 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率、胞内ROS含量

0.125 %胰酶制备单细胞悬液，Annexin VFITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司)标记细胞后进行流式细胞检测凋亡率。参照威格拉斯生物技术(北京)有限公司ROS荧光探针-DHE说明书，流式细胞仪检测胞内ROS含量，荧光显微镜观察ROS荧光显色。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 乳鼠心肌细胞鉴定

倒置显微镜下可见培养48 h原代乳鼠心肌细胞有明显搏动，成簇生长，呈多角形，折光性强(图1A)。免疫组化鉴定:对培养细胞进行α-SCA单抗组化染色，胞浆内呈棕黄色阳性表达的细胞＞95%，非心肌细胞无阳性表达(图1B)。

图1 A:心肌细胞原代培养48 h(×200)；B:心肌细胞α-SCA单抗免疫组化染色，可见胞浆内呈棕黄色细颗粒状阳性表达，胞核呈蓝紫色(×400)

2.2 MTT法测定心肌细胞存活率

与对照组相比，A/R组细胞存活率明显下降(n=9，P＜0.01)，IL-33明显减轻A/R造成的细胞损伤，A/R+rIL-33(1、10、100 ng/ml)组细胞存活率较A/R组分别高11.4%、24.2%、32.9%(n=9，P＜0.01)；C1与C组之间细胞存活率差异无统计学意义，见图2。

图2 不同浓度IL-33对心肌细胞乏氧/复氧损伤细胞存活率的影响(¯±s)

2.3 心肌细胞LDH漏出水平

A/R组细胞LDH漏出水平较对照组显著升高(11.65±0.22比8.32±0.18，P＜0.01)，与A/R组相比，重组IL-33组剂量依赖性地降低细胞LDH漏出水平，表明A/R刺激对心肌细胞造成了损伤，加入IL-33可以减少细胞损伤。C1与C组之间细胞LDH漏出水平差异无统计学意义(表1)。

表1 各组心肌细胞LDH漏出水平(±s，n=12)

表1 各组心肌细胞LDH漏出水平(±s，n=12)

注:与C组比较，aP＜0.01；与A/R组比较，bP＜0.01

组别LDH(IU/L)P值C组8.32±0.18 C1组8.34±0.21 0.883 A/R组11.65±0.22 0.001aA/R+rIL-33 1 ng/m l组9.39±0.31 0.005bA/R+rIL-33 10 ng/ml组8.75±0.27 0.001bA/R+rIL-33 100 ng/ml组8.54±0.09 0.001b

2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

流式细胞分析(AV-PI双标法)结果显示，C组细胞凋亡率为(2.92%±0.74%)；A/R组细胞凋亡率为(27.62%±2.31%)，显著高于C组(n=3，P＜0.01)；A/R+rIL-33(1、10、100 ng/ml)组细胞凋亡率分别为(20.69%±2.14%)、(14.54%± 1.79%)、(7.21%±1.90%)，明显低于A/R组(n =3，P＜0.01)；C1细胞凋亡率为(3.05%± 0.82%)，与C组之间细胞凋亡率差异无统计学意义(图3)。

图3 不同浓度IL-33对心肌细胞乏氧/复氧损伤细胞凋亡率的影响(±s)

2.5 细胞内ROS含量检测

ROS-DHE(二氢乙啶，dihydroethidium)在胞内可被ROS氧化形成氧化乙啶，在特定波长激发下可产生红色荧光。流式细胞仪检测胞内ROS含量，结果显示:与C组相比，A/R组心肌细胞内ROS含量显著升高(n= 3，P＜0.01)。A/R+rIL-33(1、10、100 ng/ml)组ROS含量较A/R组显著降低(n=3，P=0.03)；C1与C组之间细胞ROS含量差异无统计学意义(图4)。

图4 不同浓度IL-33对心肌细胞乏氧/复氧损伤胞内ROS生成量的影响(×200)

3 讨论

本实验通过外加重组IL-33干预乳鼠心肌细胞乏氧/复氧损伤，首次证明了在此损伤过程中，IL-33可以通过抑制胞内活性氧自由基生成，发挥抗心肌细胞凋亡作用，这可能成为IL-33抗心肌细胞凋亡的重要机制之一。

IL-33作为新近发现的白介素1家族成员ST2的内源性配体，其在缺血性心脏疾病过程中的作用已成为近年来的研究热点。我们的前期研究结果显示，急性心肌梗死患者血清可溶性ST2水平升高可以作为独立的预后评价因子［8］，为NT-proBNP及GRACE风险评分提供补充信息，血清IL-33与可溶性ST2比值与急性心肌梗死患者6个月后的预后评估密切相关；与此同时，我们在文献报道中发现，IL-33是体内细胞为应对出血、机械负荷增加等刺激而分泌的一种细胞因子，在ST段抬高的心肌梗死患者中，升高的血清IL-33水平与患者死亡率密切相关［9］。IL-33在大鼠和小鼠实验中均可以对低氧诱导的心肌细胞起保护作用，并且能够增强心肌功能、增加存活率。近期研究证明，IL-33可以显著降低胸主动脉缩窄术后大鼠心肌间质纤维化，改善心脏血管负荷；在大鼠心肌细胞体外乏氧培养中发现，IL-33可以通过激活NF-κB、抑制血管紧张素Ⅱ及PKCβ/JNK通路而减少细胞凋亡［2-3］。另外，在大鼠体外和体内试验中IL-33均可以增加抗凋亡蛋白家族(IAP)成员:X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)、程序性细胞死亡蛋白抑制因子1(cIAP-1)和survivin的分泌，诱导抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL表达，NF-κB可以增强IAP家族成员发挥促进心肌细胞存活的作用［1］。由于细胞凋亡信号转导过程涉及多个胞内信号级联及传导网络，目前关于IL-33对于心肌细胞抗凋亡的具体机制，尤其是氧化应激过程的机制研究并不十分充分，因此，我们基于前期研究及相关文献报道对IL-33在乏氧/复氧刺激介导的心肌细胞氧化应激损伤机制进行探索，通过分析胞内ROS生成量及心肌损伤相关标记物探索具体分子机制。

再灌注初期ROS爆发性生成是造成心肌氧化应激的主要原因，氧化应激可以进一步触发细胞内信号级联反应，诱导凋亡相关细胞因子的产生导致细胞凋亡［10-11］。LDH是目前公认的对心肌缺血损伤有诊断意义的糖酵解酶，在心肌细胞受到乏氧/复氧损伤时，心肌细胞内磷脂酶激活，自由基释放增加导致细胞膜损伤从而引起心肌酶释放增加［12］。本研究结果显示，心肌细胞经A/R损伤后，LDH活性及胞内ROS生成量显著增加，外加重组IL-33可以剂量依赖性地降低LDH活性、抑制ROS生成，从而提高心肌细胞存活率，减少细胞凋亡，为IL-33的心肌细胞生物学保护效应提供了新的线索。

此外，本研究还发现，外加100 ng/ml的重组IL-33对体外正常培养的心肌细胞没有明显的影响，表明低剂量的(≤100 ng/ml)IL-33对心肌细胞的毒性作用是微不足道的。然而IL-33是否作为胞内信使直接作用于凋亡信号通路以及高剂量的IL-33(＞100 ng/m l)对心肌细胞的作用还有待进一步探索。

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Influence of IL-33 on ROS generation in neonatal rats during anoxia/reoxygenation-induced myocardial injury

Li Guanzhen，Zhang Xinchao.
Department of Emergency，Beijing Hospital，Ministry of Health，Beijing 100730，China

Objective To investigate the protective effect of interleukin-33(IL-33)on anoxia/ reoxygenation(A/R)-induced injury and its influence on reactive oxygen species(ROS)generation in neonatal rats.M ethods Primary cardiomyocytes were isolated from neonatal Sprague-DawIey rats and were random ly divided into 6 groups:control group，control+rIL-33 100 ng/ml group，A/R group and A/R+ rIL-33(1，10，100 ng/ml)groups.A/R group and A/R+rIL-33 are subjected to 3 hours of anoxia，followed by 2 hours reoxygenation.Cardiomyocytes were identified by immunocytochemical staining.The viability of the cells was examined by MTT assay.The level of lactate dehydrogenase(LDH)was detected by a LDH enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)kit.The apoptosis of the cardiomyocytes was observed via flow cytometry(Annexin V and propidiom iodide double staining method)，ROS levels were measured by ROS fluorescent probe-dihydroethidium(DHE).Results Compared with control group，the apoptosis rate of the cardiomyocytes，level of LDH and ROS were remarkably increased(all P＜0.01)，the viability of cardiomyocytes was impaired significantly in A/R group(P＜0.01).Compared with A/R group，the apoptosis rate of the cardiomyocytes(P＜0.01)，level of LDH and ROS production(P=0.03)were significantly decreased(P＜0.01)，and the viability of cardiomyocytes enhanced significantly in rIL-33(1，10，100 ng/ml)groups in a dose-dependent manner(all P＜0.01).There was no significant difference between control group and control+rIL-33 100 ng/m l group.Conclusions IL-33 prevents apoptosis and improves survival during the anoxia/reoxygenation-induced cardiomyocyte injury，which may be due to the effects of anti-oxidative mechanism and reduce ROS generation.

Zhang Xinchao，Email:xinchaoz@163.com

2013-12-09)

(本文编辑:周白瑜)

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.02.015

100730卫生部北京医院急诊科

张新超，电子信箱:xinchaoz@163.com