宫颈鳞癌组织圆柱瘤基因mRNA表达及其意义

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(武汉市第一医院，湖北 武汉 430022 1 妇产科； 2 中心实验室)

圆柱瘤基因(CYLD)是一种新发现的抑瘤基因，其缺失可导致头部或面部的皮肤肿瘤，如家族性圆柱瘤[1]。CYLD基因在人体内广泛分布，作为一种肿瘤抑制基因正受到越来越多学者的关注。最新研究结果显示，CYLD基因在多种人类肿瘤中表达下调，如结肠癌、肝癌等[2]。HIRAI等[3]在其构建的两株宫颈癌细胞株中发现存在CYLD基因的丢失。然而，CYLD基因与宫颈癌发生发展的关系国内尚未见报道。本研究通过检测CYLD mRNA在宫颈鳞癌组织中的表达，初步探讨其与宫颈癌发生发展的关系。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2010年6月—2013年2月，选择在我院接受手术治疗的病人129例，病人术前均未接受放、化疗，均有完整的临床和病理资料。其中宫颈鳞癌45例，病人年龄36～64岁，中位年龄46.5岁；根据FIGO 2009年分期标准进行临床分期:Ⅰ期22例，≥Ⅱ期23例；组织学分级(按WHO标准):Ⅰ-Ⅱ级(高、中分化)29例，Ⅲ级(低分化)16例;局部肿瘤大小:<4 cm者28例，≥4 cm者17例;淋巴结转移:有转移16例，无转移29例。宫颈上皮内瘤变(CIN)64例，包括CINⅠ 26例，CINⅡ-Ⅲ 38例；病人年龄34～66岁，中位年龄46岁。对照组20例，因良性病变行子宫全切，病人年龄37～65岁，中位年龄44岁。3组病人年龄差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 主要试剂

探针、原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德公司;DEPC由美国Sigma公司生产;DAB显色试剂盒购自福州迈新公司。CYLD探针序列为：5′-TGA-ATGGTAAAGAGTGGAATCTGTTCTCGGTGG-TC-3′,5′-ACTGAATGGTAAAGAGTGGAATCT-GTTCTCGGTGG-3′,5′-ATACTTTATCCTCCAC-TCACATCTCAGTCTACAAT-3′。

1.3 CYLD mRNA原位杂交技术(ISH)检测

所有手术病理标本均经40 g/L甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片备用。切片中滴加地高辛标记的CYLD探针，40 ℃恒温杂交16 h，生物素化鼠抗地高辛抗体37 ℃温浴60 min，SABC孵育后DAB显色。用已知阳性切片作为阳性对照，用探针稀释液替代探针作为阴性对照。操作严格按照说明书进行。

1.4 结果判断

CYLD mRNA原位杂交阳性信号为细胞质中出现明显黄色或棕黄色颗粒。选择视野时，每个组织点沿相互垂直的2条直径方向选择5个高倍视野，共计数1 000个细胞，按阳性细胞占细胞总数的百分数及着色深浅进行结果判定[4]。

1.5 统计学处理

采用SPSS 11.5软件进行统计学处理，组间比较采用χ2检验。

2 结 果

2.1 宫颈组织中CYLD mRNA的表达

CYLD mRNA阳性表达主要定位于细胞质(图1)。CYLD mRNA在宫颈鳞癌、CINⅡ-Ⅲ、CINⅠ及正常宫颈组织中的阳性表达率分别为42.2%(19/45)、52.6%(20/38)、73.1%(19/26)和80.0%(14/20)，宫颈鳞癌、CINⅡ-Ⅲ组织中CYLD mRNA的阳性表达率明显低于正常宫颈组织，差异有统计学意义(χ2=7.85、4.42，P<0.05)；CINⅠ组织与正常宫颈组织相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 宫颈鳞癌CYLD mRNA表达与临床病理特征的关系

宫颈鳞癌CYLD mRNA阳性表达率与临床分期及淋巴结转移有关(χ2=4.64、5.59，P<0.05)，而与组织学分级、肿瘤大小、病人年龄等均无关(P>0.05)。见表1。

3 讨 论

2003年，TROMPOUKI等[5]报道了一种新的肿瘤抑制基因——CYLD,它是在研究人类头帕肿瘤综合征时被发现的。多位学者研究显示，CYLD等位基因突变或缺失可导致多种皮肤肿瘤的发生,如多发性家族性毛发上皮瘤、家族性圆柱瘤等[6-7]。CYLD基因位于人类染色体的16q12-13,其mRNA的长度为5 371 bp,共有20个外显子[7]。其编码的CYLD蛋白为含956个氨基酸残基的蛋白质,包括细胞骨架关联蛋白甘氨酸保守结构域(CAP-Gly)和C-末端结构域,后者负责编码泛素羧基末端水解酶 (UCH),能够从蛋白底物上除去多聚泛素链[8]。CYLD参与细胞内多种多信号调控途径, 它对信号途径的调控依赖于其去泛素化活性。

A：宫颈鳞癌；B：CINⅠ。200倍。

表1 宫颈鳞癌组织中CYLD mRNA表达与临床病理特征的关系

CYLD蛋白的一个重要的特点是具有和肿瘤坏死因子受体相关因子2 (TRAF2)和IκB激酶复合物调节亚基(NEMO)结合的特异性位点。 TRAF2作为接头蛋白和调控因子在几乎所有的TNF-R1介导的NF-κB激活过程中起重要作用。NEMO是IκB激酶复合物3个亚单位中的调节亚基,为NF-κB的必需调控因子。BRUMMEKAMP等[9]的研究结果表明, CYLD与NEMO相结合后使TRAF2去泛素化，从而阻断TRAF2的下游信号通路，抑制NF-κB激活,在抑制肿瘤方面发挥着重要作用。而一旦CYLD活性丧失,就不能抑制TRAF2的信号转导功能,从而激活NF-κB途径,开启下游信号途径,导致细胞的异常增殖并形成肿瘤[10]。

CYLD基因在人体组织中广泛存在，它不仅是皮肤肿瘤发生的主要分子机制,而且在其他肿瘤的形成和发展中也有重要作用。程永波等[11]研究显示，肺癌细胞CYLD基因的表达较正常肺组织下调，有效增强肺癌细胞株A549/H460的CYLD基因表达后，FasL膜蛋白可通过Fas信号诱导其显著坏死。HELLERBRAND等[12]应用RT-PCR等方法对肝癌细胞和肝癌组织的研究显示，在不同的肝癌细胞株和癌组织中CYLD基因的表达下调,同时NF-κB的活性增强。

本文的研究结果显示，CYLD mRNA在CINⅠ组织中的表达率与正常宫颈组织比较差异无统计学意义，但在CINⅡ-Ⅲ组织即出现异常低表达，在宫颈癌组织中CYLD表达率更低，两者与正常宫颈组织比较差异均有显著性。提示随着疾病的发展，CYLD基因的阳性表达率呈下降趋势，提示CYLD基因表达异常可能是宫颈病变中的重要事件及早期事件。进一步分析宫颈鳞癌组织CYLD mRNA表达与病人临床病理特征的关系，结果显示，临床Ⅱ期及以上病人宫颈癌组织中CYLD mRNA的表达率明显低于Ⅰ期病人；淋巴结转移病人宫颈癌组织中CYLD mRNA的表达率明显低于无淋巴结转移者，而CYLD mRNA表达与组织学分级、肿瘤大小、病人年龄等无明显相关性。提示CYLD可能作为宫颈癌进展过程中极具价值的生物学危险因子在其发生发展中发挥重要的作用。

综上所述，CYLD mRNA在宫颈组织中异常低表达可能与宫颈癌的发生发展有关。但宫颈癌的发病原因及作用机制复杂，CYLD的表达下降可能不足以引起宫颈细胞异常转化，还需要多种癌基因和抑癌基因间的相互调节、协同作用。本研究为今后进一步探讨宫颈癌发病机制提供了初步的分子生物学依据。

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[2] HELLERBRAND C, BUMES E, BATAILLE F, et al. Reduced expression of CYLD in human colon and hepatocellular carcinomas[J]. Carcinogenesis, 2007,28(1):21-27.

[3] HIRAI Y, KAWAMATA Y, TAKESHIMA N, et al. Conventional and array-based comparative genomic hybridization analyses of novelcell linesharboring HPV18 from glassy cell carcinoma of the uterine cervix[J]. Int J Oncol, 2004,24(4):977-986.

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[5] TROMPOUKI E, HATZIVASSILIOU E, TSICHRITZIS T, et al. CYLD is adeubiquitinating enzyme thatnegatively regulates NF-kappaB activation by TNFR family members[J]. Nature, 2003,424 (6950):793-796.

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[7] 梁燕华,何平平,杨森. 多发性家族性毛发上皮瘤致病基因的确定[J]. 中华皮肤科杂志, 2005,38(2):71-73.

[8] KOVALENKO A, CHABLE-BESSIA C, CANTARELLA G, et al. The tumour suppressor CYLD negatively regulates NF-κB signalling by deubiquitination[J]. Nature, 2003,424(6950):801-805.

[9] BRUMMELKAMP T R, NIJMAN S M, DIRAC A M, et al. Loss of the cylindromatosis tumour suppressor inhibits apoptosis by activating NF-kappaB[J]. Nature, 2003,424(6950):797-801.

[10] 王少敏,叶孟,林蕾. 肿瘤抑制因子CYLD的调控途径[J]. 医学分子生物学杂志, 2007,4(1):78-81.

[11] 程永波,张国强,戴纪刚,等. 圆柱瘤基因(CYLD)的增强表达介入Fas/FasL途径诱导人肺癌细胞株A549/H460坏死的研究[J]. 中国医药导报, 2012,9(12):5-8.

[12] HELLERBRAND C, BUMESE, BATAILLE F, et al. Reduced expression of CYLD in human colon and hepatocellular carcinomas[J]. Carcinogenesis, 2007,28(1):21-27.