水生动物金属硫蛋白分子毒理学研究进展

盛 樟，竺俊全

(宁波大学 海洋学院，浙江 宁波 315211)

金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是细胞内一类低分子量(6～7 kDa)、富含半胱氨酸(Cys)的蛋白超家族，最早发现于马肾皮质中[1]，迄今为止，研究发现MT广泛存在于动物、植物和一些微生物体内。近年来，伴随工业化进程的不断推进，大量排放的工业废水使各水域遭受不同程度的重金属污染，重金属在水生生物体内的富集超过机体自身所能承载的负荷，从而对它们的生长、繁育、生理代谢等造成毒性危害，同时可能引起遗传物质变异，使机体免疫力、存活力下降，物种多样性丧失[2]。MT能够调节机体必需重金属的稳态及对有害重金属进行解毒，并起氧化应激防护作用，因而可作为指示水环境重金属污染的一种生物学指标。水生动物MT分子毒理学是指对水生动物体内MT结构与性质及其在重金属胁迫下的组织表达与功能进行研究。本文就该领域的研究进展进行综述。

1 金属硫蛋白概述

1.1 金属硫蛋白的结构

Cho等[3]研究一种鲤科淡水鱼HemibarbusmylodonMT基因组结构后发现，外显子/内含子以GT/AG拼接规则形成一种三重结构，而在斑马鱼(Daniorerio)[4]及蟹类[5]体内也发现由3个外显子与2个内含子组成的MT基因存在这种保守的拼接信号。水生脊椎动物MT基因5′侧翼调控区普遍存在转录因子结合位点，能够结合AP-1、Sp1及HNF-5等转录因子[6]，而且5′侧翼调控区中的保守基序如重金属应答元件(MREs)是金属应答转录因子MTF-1的靶向位点，当机体遭遇重金属胁迫等损伤时，二者结合以调控基因的表达，从而使细胞作出应激应答[4]。Ren等[7]对中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)MT基因组结构分析后发现基因5′侧翼调控区也存在多个转录因子结合位点及MREs，在该基因表达调控方面发挥不同程度的作用。水生动物MT基因3′非编码区(3′-UTR)存在保守的多聚腺苷酸信号(ATTAAA或AATAAA)[4,5,7,8]，而在蟹类体内还发现3′-UTR分布有“CACC”基序[5,8,9]，这些基序可能对MT mRNA的定位至关重要。

MT主要分布于细胞质内，构成一类小分子蛋白超家族，不含芳香族氨基酸，一般具有高度保守的18～23个Cys，Cys上的巯基可结合特异的重金属离子。MT一级结构最显著的特征是含有Cys-Cys、Cys-X-Cys、Cys-X-X-Cys、Cys-X-X-X-Cys基序(X表示除Cys外的其它氨基酸)[7-9]，这些基序对重金属离子如铜、锌、镉、汞等表现出强亲和力[10]。Mao等[8]研究日本蟳(Charybdisjaponica)MT二级结构发现存在一段保守的螺旋区。哺乳类MT的三维结构分为C末端的α结构域与N末端的β结构域，分别可结合4个重金属离子与3个重金属离子；在无脊椎动物如蟹类体内，MT的两个结构域分别可结合3个重金属离子[10]。

1.2 金属硫蛋白的功能

MT的结构特征决定其能与重金属离子结合，可作为必需重金属的储存库，参与锌、铜等必需金属元素的稳态调节过程，以满足机体新陈代谢的需求。有害重金属(如镉、汞等)进入细胞后，会与胞内必需重金属竞争配体，此时，MT的巯基能与有害重金属强烈螯合，发挥解毒作用，及时将有害物质排出体外。Amiard等[11]研究结果显示，镉胁迫后MT表达量受诱导而升高，进而清除羟基和过氧化物，使机体抵御氧化应激反应。

1.3 金属硫蛋白的分类与分布

综合分子量、重金属结合位点、基因序列、染色体结构等多种因素，可将MT划分为4种异构体，即MT-Ⅰ，MT-Ⅱ，MT-Ⅲ和MT-Ⅳ。其中，前两者在大多数动物的内脏器官中均有分布，尤以肝脏、肾脏为主；后两者一般存在于特化细胞中，如MT-Ⅲ主要分布于哺乳类中枢神经系统星形胶质细胞与神经元中，MT-Ⅳ发现于复层上皮细胞中[12]。

图1斑马鱼MT氨基酸序列与其它物种比对[4]

Fig 1 Alignment of zebrafish MT amino acid sequence with other species[4]

2 水生动物金属硫蛋白分子毒理学

2.1 鱼类金属硫蛋白分子毒理学

国际上对模式生物斑马鱼MT分子毒理学的研究日益增多。Chen等[4]揭示了斑马鱼MT序列与其它物种具有高度的同源性(见图1)。Riggio等[13]研究发现，斑马鱼卵母细胞发育过程中铜和锌含量变化与MT表达量变化呈正相关，而胚胎发育过程中铜和锌含量变化与MT表达量变化无明显相关性；当斑马鱼胚胎暴露于镉时MT含量在囊胚期被诱导升高，而在原肠期无此现象；使用DNA甲基转移酶抑制剂预处理斑马鱼原肠胚，观察到镉诱导了MT的合成，据此推测DNA甲基化可能是调控基因表达的一个因素。Yan等[14]对斑马鱼MT基因结构进行研究后提出，启动子区包含4个MREs，其中距离转录起始位点740 bp处的1个MRE对重金属诱导MT基因表达具有重要作用，而靠近TATA框的3个MRE对MT基因的诱导表达没有显著作用。Chan等[15]经探究发现，当斑马鱼的胚胎-幼体用于体内试验时，汞离子是对MT mRNA最有效的诱导物，而对斑马鱼肝脏细胞系进行体外试验时，镉离子是最有效的诱导物。Cheuk等[16]使用斑马鱼的肝脏细胞系和尾鳍细胞系，研究了多种重金属离子对MT和MTF-1 mRNA水平的诱导情况，结果表明，镉离子是两个细胞系中MT的最有效的诱导物，在尾鳍细胞系中亦对MTF-1 mRNA的水平有明显的剂量依赖性诱导。

Cho等[17]从细鳞泥鳅(Misgurnusmizolepis)体内获得MT-I的2种亚型——MT-IA与MT-IB。对于这2种亚型，研究者测定得到一个头尾串联的基因组组织方式，鉴定了基因组的保守性特征，显示二者编码区序列具有高度的同源性，且通过检测发现，近亲祖先的一个基因复制事件导致了二者的分离。然而，这2种亚型的5′ 侧翼上游区在多种转录因子结合基序的组织排列方式上存在着很大差异。用镉、铬、铜、铁、锰、镍和锌分别处理细鳞泥鳅48 h，MT-IA和MT-IB的转录调控方式存在明显不同，且应答类型因金属和组织种类而异。

将一组浓度梯度的镉离子依次与浓度固定的锌离子联合胁迫鲫鱼(Carassiusauratus)，肝脏和肾脏中MT表达量的总体变化趋势较一致，均呈现先升高后降低再升高。在0～12 h内鲫鱼肝脏和肾脏中MT增加量与镉含量呈正相关，表明联合胁迫可诱导鲫鱼组织中MT的表达[18]。

Vergani等[10]对虹鳟(Oncorhynchusmykiss)体内重组体MT-A进行了克隆、纯化与鉴定，并研究了镉胁迫下该重组体结合金属的能力，结果表明，随着MT-A与镉结合，在254 nm处出现吸收峰，且当镉与MT-A形成复合体结构后，会诱导蛋白质折叠。

用镉对河豚(Takifuguobscurus)进行处理，相比脑、鳃丝和肾脏，肝脏中MT表达量最高，肌肉中MT表达很弱。早期(6 h时)脑中MT表达量最高，随后肠中MT被持续诱导表达。在所有组织中，MT mRNA表达均呈现重金属浓度依赖性。然而，与其它组织相比，脑和肝脏中仅很低的镉浓度即可诱导MT mRNA表达，表明这两种组织中MT能够发挥高效的解毒作用[19]。

Isani等[20]对金头鲷(Sparusaurata)体内镉含量及其生化应答情况进行分析后发现，未受镉胁迫时，鳃丝中镉含量显著高于肝脏，而当机体暴露于0.1 mg/L镉后，镉在肝脏中随胁迫时间延长而快速累积，在血浆、肌肉和肾脏中也能检测到镉。镉胁迫4 d后，肝脏与肾脏中MT表达量无显著变化，但11 d后镉-MT复合体含量明显升高。MT表达量达到峰值时，锌与铜的浓度也相应较高。以上结果表明，鱼类的鳃丝是直接暴露于水体的器官，重金属离子首先进入鳃丝，经血液循环分布于各器官，最后主要累积于代谢场所——肝脏与肾脏。镉胁迫时间延长后MT与镉结合形成复合体以达到解毒的作用，并相应提高了必需重金属锌和铜的含量，以调节金属在机体内的动态平衡。另外，红细胞彗星试验结果显示低浓度(0.1 mg/L)镉胁迫11 d不足以引起金头鲷DNA损伤，而镉对其组织细胞学结构造成的损伤尚待进一步研究。

2.2 甲壳类金属硫蛋白分子毒理学

Ren等[7]对中华绒螯蟹的MT-ⅠcDNA和基因组序列进行了克隆与分析，并对MT-Ⅰ基因在肝胰腺中的铜诱导表达及在精巢中的季节性表达情况进行了研究。结果表明，肝胰腺中MT-Ⅰ基因表达量在0.1 mg/L铜胁迫7 d时达到峰值，后随时间延长而逐渐下降，由此可知MT基因表达水平不会在组织中无限制升高，在重金属胁迫早期，其表达量会逐渐上升，然而，随着毒性的不断积累，超过一定程度后，MT应答效应会趋于减弱，造成机体新陈代谢紊乱，某些蛋白质的合成受阻，其中也包含MT合成量减少；精巢中MT-Ⅰ基因表达量在8月最高，在9月急剧下降，至11月进入季节性低谷，说明MT-Ⅰ基因的表达与该物种的生殖季节有着内在的关联，可能在生殖与发育中发挥重要作用。

长江华溪蟹(Sinopotamonyangtsekiense)经镉处理后，心脏、鳃丝和肝胰腺等组织中镉的积累量随处理时间的延长而增加；MT基因表达量随水体中镉浓度的升高而呈现上升势态，但其与同一镉浓度处理过程中镉的积累量无关，其中，肝胰腺中MT基因表达量受镉诱导的倍数最高[21]。Ma等[22]在河南华溪蟹(Sinopotamonhenanense)体内发现了类似的现象，肝胰腺中MT基因表达量高于鳃丝、肌肉和卵巢。由此可见，作为蟹类体内主要的解毒器官，肝胰腺中MT对重金属胁迫的应答效应最强。

眼斑龙虾(Panulirusargus)体内MT基因在肝胰腺、肠、神经组织和肌肉中广泛表达，在肝胰腺中表达量最高，在肌肉和神经组织中最低。此外，重金属对MT表达的调控呈现出差异性：镉能诱导除肌肉外的所有组织中MT mRNA水平升高，对神经组织的诱导效应最为明显；锌仅在肝胰腺中发挥诱导作用；铜对所有组织的MT mRNA均无诱导效应[23]。以上结果表明肝胰腺中MT对镉解毒与锌稳态调节具有重要作用；神经组织中MT能够保护这种具有高度敏感性的组织免受镉引发的神经毒性。

由于近年来MT分子毒理学研究主要集中于MT在机体内主要解毒器官(如肝脏、肾脏)及与水体直接接触器官(如鳃丝)中的表达与功能分析，有关其对水生动物尤其是水生无脊椎动物生殖与发育的影响等方面的研究较少。Mao等[8]对日本蟳MT基因序列及蛋白结构进行了分析，并检测了精子形成期MT mRNA的时空表达模式。研究表明，日本蟳MT在C末端上多出非保守性Cys，可能有利于抵御重金属污染。在早期精细胞中，MT mRNA主要聚集于细胞核的一端；中期精细胞中，MT mRNA主要集中于原顶体中，有一些存在于膜复合体中；后期精细胞及成熟精子中，MT mRNA分布于顶体管和膜复合体中。Xiang等[9]对三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)精巢中MT-Ⅰ及MT-ⅡmRNA进行定位分析后获得的结果与以上基本一致。由于镉离子与钙离子结构相似，易取代钙离子参与一些相关生理反应，根据以上结果推测顶体管中MT的作用可能是保护顶体及与钙离子通道有关的顶体反应，免受镉胁迫引发的损伤。

2.3 软体动物金属硫蛋白分子毒理学

Wang等[24]发现在一种淡水双壳贝Pyganodongrandis中，由于其鳃丝直接暴露于水体中，与重金属直接接触，是水环境中有害物质的主要吸收器官，在一组浓度梯度镉离子的胁迫下，鳃丝中MT表达量与镉浓度呈现正相关关系。

太平洋牡蛎(Crassostreagigas)的MT基因编码区序列上存在低水平的多态现象，其MT-Ⅰ和MT-Ⅱ两种异构体可能参与解毒反应[25]。这种牡蛎生活在一个广泛的潮高范围内，常会遭遇较大的温度波动。对MT和热休克蛋白(HSP)这两种应激蛋白的基因表达水平进行定量分析，结果显示生活在低潮高处和高潮高处的牡蛎其鳃丝、套膜和消化腺中这两种蛋白的含量相近。相反，性腺中内生的HSP和MT的含量在配子发生过程中有显著变化。在雌性个体的性腺中，HSP70和MT的组成型水平从未成熟(或静止)阶段增加至成熟阶段，在产卵后下降。在雄性个体的性腺中也观察到了相同的变化情况，而在性完全成熟后蛋白含量下降。在产卵期雌性个体HSP和MT的表达量比雄性个体更高。因此，Meistertzheim等提出了卵细胞中高水平的应激蛋白可能提高牡蛎后代存活力这一假说[26]。

3 总结与展望

重金属是生物机体内生理生化过程中不可缺少的因素。然而，在天然因素与人为因素的共同作用下，大量重金属流入各海域与江河中，超越了水生生态系统的承受能力，使水生生物的生存与繁殖面临严重的威胁。水生动物是水环境中极其重要的组成部分，重金属污染会降低水生动物的生殖与适应能力，引发动物体内各项生理生化机能损伤，造成新陈代谢紊乱，甚至在分子水平上对机体产生致命效应。本文简要综述了多种水生动物MT分子毒理学研究进展，分析了MT基因序列及蛋白结构的明显特征，揭示了MT在水生动物体内具有维持必需重金属稳态、对有害重金属解毒、抵御氧化、维持机体正常的生长发育及生理代谢等作用，可作为监测水环境重金属污染的生物学指标。关于MT的研究已逾50年，对其结构、功能与表达等方面已有一定了解。国内外对水生动物MT分子毒理学研究已广泛开展，目前主要集中于研究MT在环境监测方面的应用，但有关MT基因序列上游侧翼调控区多种应答元件的作用机制及MT对水生动物发育的影响等方面少有涉及，有待深入探讨以丰富MT研究资料。

参考文献：

[1]Margoshes M, Vallee B L. A cadmium protein from equine kidney cortex[J]. Journal of the American Chemical Society, 1957, 79:4813-4814.

[2]张传永, 刘 庆, 陈燕妮.重金属对水生生物毒性作用研究进展[J]. 生命科学仪器, 2008, 6:3-7.

[3]Cho Y S, Lee S Y, Kim K Y, et al. Gene structure and expression of metallothionein during metal exposures inHemibarbusmylodon[J]. Ecotoxicology and Environment Safety, 2008, 71:125-137.

[4]Chen W Y, John J A C, Lin C H, et al. Expression of metallothionein gene during embryonic and early larval development in zebrafish[J]. Aquatic Toxicology, 2004, 69:215-227.

[5]Leignel V, Marchand J, Moreau B, et al. Metallothionein genes from hydrothermal crabs(Bythograeidae,Decapoda): characterization, sequence analysis, gene expression and comparison with coastal crabs[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C, 2008, 148:6-13.

[6]Haq F, Mahoney M, Koropatnick J. Signaling events for metallothionein induction[J]. Mutation Research, 2003, 533:211-266.

[7]Ren F, Jiang H, Sun J L, et al. Cloning, characterization, expression, and copper sensitivity of the metallothionein-1 gene in the Chinese mitten crab,Eriocheirsinensis[J]. Molecular Biology Reports, 2011, 38(4):2383-2393.

[8]Mao H, Tan F Q, Wang D H, et al. Expression and function analysis of metallothionein in the testis of stone crabCharybdisjaponicaexposed to cadmium[J]. Aquatic Toxicology, 2012(124/125)：11-21.

[9]Xiang D F, Zhu J Q, Jin S, et al. Expression and function analysis of metallothionein in the testis ofPortunustrituberculatusexposed to cadmium[J]. Aquatic Toxicology, 2013(140/141):1-10.

[10]Vergani L, Grattarola M, Dondero F, et al. Expression, purification, and characterization of metallothionein-A from rainbow trout[J]. Protein Expression and Purification, 2003, 27:338-345.

[11]Amiard J C, Amiard-Triquet C, Barka S, et al. Metallothioneins in aquatic invertebrates: their role in metal detoxication and their use as biomarkers[J]. Aquatic Toxicology, 2006, 76:160-202.

[12]Thirumoorthy N, Sunder S A, Kumar M K T, et al. A review of metallothionein isoforms and their role in pathophysiology[J]. World Journal of Surgical Oncology, 2011, 9:54-60.

[13]Riggio M, Filosa S, Parisi E, et al. Changes in zinc, copper and metallothionein contents during oocyte growth and early development of the teleostDaniorerio(zebrafish)[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C, 2003, 135:191-196.

[14]Yan C H M, Chan K M. Cloning of zebrafish metallothionein gene and characterization of its gene promoter region in HepG2 cell line[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2004, 1679:47-58.

[15]Chan K M, Ku L L, Chan P C Y, et al. Metallothionein gene expression in zebrafish embryo-larvae and ZFL cell-line exposed to heavy metal ions[J]. Marine Environmental Research, 2006, 62:83-87.

[16]Cheuk W K, Chan P C Y, Chan K M. Cytotoxicities and induction of metallothionein(MT) and metal regulatory element(MRE)-binding transcription factor-1(MTF-1) messenger RNA levels in the zebrafish (Daniorerio) ZFL and SJD cell lines after exposure to various metal ions[J]. Aquatic Toxicology, 2008, 89:103-112.

[17]Cho Y S, Lee S Y, Kim K Y, et al. Two metallothionein genes from mud loachMisgurnusmizolepis(Teleostei；Cypriniformes): gene structure, genomic organization, and mRNA expression analysis[J]. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B, 2009, 153:317-326.

[18]周彦锋, 吴 伟, 尤 洋, 等.重金属镉锌联合胁迫下鲫鱼组织中金属硫蛋白的动态变化[J]. 生态与农村环境学报, 2010, 26(1):63-67.

[19]Kim J H, Wang S Y, Kim Il C, et al. Cloning of a river pufferfish (Takifuguobscurus) metallothionein cDNA and study of its induction profile in cadmium-exposed fish[J]. Chemosphere, 2008, 71: 1251-1259.

[20]Isani G, Andreani G, Cocchioni F, et al. Cadmium accumulation and biochemical responses inSparusauratafollowing sub-lethal Cd exposure[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2009, 72:224-230.

[21]Gao A B, Wang L, Yuan H. Expression of metallothione in cDNA in a freshwater crab，Sinopotamonyangtsekiense，exposed to cadmium[J]. Experimental and Toxicologic Pathology, 2012, 64:253-258.

[22]Ma W, Wang L, He Y, et al. Tissue-specific cadmium and metallothionein levels in freshwater crabSinopotamonhenanenseduring acute exposure to waterborne cadmium[J]. Environmental Toxicology, 2008, 3:393-400.

[23]Molt E, Bonzn-Kulichenko E, Arco A D, et al. Cloning, tissue expression and metal inducibility of an ubiquitous metallothionein fromPanulirusargus[J]. Gene, 2005, 361: 140-148.

[24]Wang D, Couillard Y, Campbell P G C, et al. Changes in subcellular metal partitioning in the gills of freshwater bivalves(Pyganodongrandis) living along an environmental cadmium gradient[J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1999, 56:774-784.

[25]Tanguy A, Mura C, Moraga D. Cloning of a metallothionein gene and characterization of two other cDNA sequences in the Pacific oysterCrassostreagigas(CgMT1)[J]. Aquatic Toxicology, 2001, 55:35-47.

[26]Meistertzheim A L, Lejart M, Go c N L, et al. Sex-, gametogenesis, and tidal height-related differences in levels of HSP70 and metallothioneins in the Pacific oysterCrassostreagigas[J]. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A, 2009, 152:234-239.