LKB1和血管内皮生长因子在胃癌组织中的表达及其临床意义

黄悦 夏雷 莫伏根 徐新宇

LKB1和血管内皮生长因子在胃癌组织中的表达及其临床意义

黄悦 夏雷 莫伏根 徐新宇

目的探讨LKB1和血管内皮生长因子（VEGF）在胃癌中的表达及临床意义。方法采用免疫组织化学（SP）法检测115例胃癌组织和20例胃正常组织中LKB1和VEGF的表达，并探讨其与胃癌分期、淋巴结转移、Lauren's分型及预后的关系。结果LKB1在胃癌组织中的阳性率为20.9%，低于正常胃组织中的95.0%（P＜0.01）；VEGF在胃癌组织中的阳性率为64.3%，高于正常胃组织中的5.0%（P＜0.01）。LKB1在胃癌组织中的低表达与胃癌的TNM分期、淋巴结转移、Lauren's分型及预后有关（P＜0.05）；VEGF在胃癌中的表达与淋巴结转移、远处转移、TNM分期及预后相关（P＜0.05）。结论LKB1的低表达与胃癌的发生、发展有关，对胃癌恶性生物学行为的评估及预后判断具有重要的指导意义。

胃癌；LKB1；血管内皮生长因子；免疫组织化学

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居我国恶性肿瘤的前二位［1］，胃癌的发生和发展涉及到多种基因、多种分子，故在基因水平上找寻新的预后指标对胃癌的研究有着深刻的意义。LKB1又被称为STK11（serine theronineprotein kinase 11），是一种抑癌基因，编码一种丝氨酸⁃苏氨酸蛋白激酶，与细胞生长和凋亡、细胞周期改变、细胞极性的维持和胚胎血管发育密切相关，其缺失、突变参与了多种恶性肿瘤的发生、发展［2］。血管内皮生长因子（VEGF）在肿瘤的血管生成中起着关键作用，VEGF是目前所知的作用最强的促血管生成因子。本研究通过检测LKB1和VEGF在人胃癌组织中的表达，观察LKB1与VEGF之间的关系，进而探讨其在胃癌生长和转移过程中的作用及其与临床病理特征之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 115例胃癌标本，均为江苏省肿瘤医院2006年1～12月手术切除标本，且病理证实为原发性胃癌。患者男73例，女42例，年龄37～80岁（中位年龄61岁）。20例胃正常组织取自于距癌组织＞5 cm的切缘正常黏膜组织。患者术前均无辅助化疗或内分泌治疗史。所有病例均经病理证实，同时依据病人病变部位、侵犯深度、淋巴结转移、TNM分期、Lauren's分型及有无神经脉管侵犯进行分组。

1.2 方法 所有标本均经10%福尔马林溶液固定、石蜡包埋、连续4μm切片，分别进行HE和SP免疫组化染色。检测所用特异性一抗为鼠抗人LKB1单克隆抗体ab15095（美国Abcam公司产品），工作浓度1∶100；鼠抗人VEGF单克隆抗体（上海长岛生物技术有限公司）工作浓度1∶200。采用免疫组化SP法染色，石蜡切片脱蜡、水化、自来水冲洗。根据第一抗体要求对组织进行相应的抗原修复。PBS冲洗3次，每次3 min，滴加第一抗体，4℃过夜。PBS冲洗3次，每次3 min，除去PBS，滴加生物素标记的第二抗体，室温孵育15 min。PBS冲洗3次，每次3min，除去PBS，滴加新鲜配制的DAB显色试剂显色。自来水冲洗终止显色，苏木素复染，PBS返蓝。经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。染色过程中设阳性和阴性对照。阳性对照用已知阳性切片，阴性对照用PBS代替一抗。

1.3 结果判断 对免疫组化结果进行双盲阅片，参照Kountourakis等［3］的研究标准：LKB1以胞浆或胞核有棕黄色颗粒沉着为阳性，VEGF以胞浆有棕黄色颗粒沉着为阳性；判断标准：－：无染色或者＜10%肿瘤细胞表达；＋：＞10%轻微或者几乎很少部分表达；＋＋：全部细胞膜弱到中度染色或者＞10%胞浆弱到中度表达；＋＋＋：＞10%肿瘤细胞强表达。我们以＋＋、＋＋＋作为有表达（阳性），＋、－作为无表达（阴性）。

1.4 统计学分析 所有数据均采用SPSS 16.0软件包进行统计。计数资料采用卡方检验进行统计；采用Kap⁃lan⁃Meier法绘制生存曲线，相关分析采用Spearmen相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LKB1和VEGF在胃组织中的表达 LKB1和VEGF在正常胃黏膜组织及胃癌中的表达情况见表1。其中，LKB1在胃癌组织中的阳性率为20.9%，低于正常胃组织中的95.0%（P＜0.01），VEGF在胃癌组织中的阳性率为64.3%，与在正常胃黏膜组织的表达（5%）存在差异（P＜0.01）。

表1 LKB1及VEGF在胃癌及正常胃黏膜组织中的表达情况（n）

2.2 胃癌组织中LKB1及VEGF的表达与临床病理因素的关系 LKB1在胃癌组织中的表达程度与胃癌的TNM分期、淋巴结转移、Lauren's分型有关（P＜0.05或0.01）；VEGF在胃癌中的表达与淋巴结转移、远处转移、TNM分期相关（P＜0.05或0.01）。见表2。

表2 胃癌组织中LKB1及VEGF的表达与临床病理因素的关系（n＝115）

续表

2.3 胃癌组织中LKB1及VEGF表达的相关性 相关分析显示，胃癌组织中LKB1及VEGF表达呈负相关（r＝－0.199，P＜0.05）

LKB1＋－VEGF＋11 63－13 28

2.4 胃癌组织中LKB1及VEGF的表达与预后的关系 Kaplan⁃Meier回归分析显示，LKB1及VEGF的表达与预后显著相关（P＜0.05）；见图1。

3 讨论

1998年由Hemminki等采用定位候选克隆的方法从黑斑息肉综合征（Peutz⁃Jeghers syndrome PJS）患者的血细胞中克隆出LKB1［4］。LKB1定位于人19p13.13，cDNA全长2158 bp，编码区1302 bp，有9个外显子。编码的LKB1为一种60 kD的由433个氨基酸组成的丝氨酸⁃苏氨酸蛋白激酶，含有一个激酶区域（位于50～337密码子），其N端含有一个核定位信号区和胞浆定位区。LKB1在细胞内分布较广泛，在胎儿和成人的所有组织中均有表达，且在成人以上皮、睾丸生精小管和肝脏中表达最强。LKB1的主要功能是通过使细胞周期阻滞在G1期而抑制细胞的增殖，促进细胞凋亡［5］。此外，LKB1在调节胚胎血管形成以及细胞极性的诱导等方面也有着重要的生物学意义［6］。目前认为，LKB1的功能异常不仅是PJS的致病因素，同时它还是一个重要的抑癌基因［7］。

LKB1的胚系突变或体细胞突变广泛存在于多种肿瘤的发生发展中，其作用机制可能与LKB1的胚系突变或体细胞突变，形成破坏LKB1活性的截短蛋白，产生一种失活的丝氨酸⁃苏氨酸蛋白激酶有关［8］；当LKB1突变和丢失后，其编码的蛋白质失去其生物学活性，从而导致肿瘤发生。LKB1的突变更容易诱发肺癌的发生，在所有肺癌组织类型中包括小细胞肺癌都存在LKB1的突变表达。LKB1在肿瘤组织中的表达强度明显低于正常对照组，且高度恶性组中的表达强度低于低度恶性组［9］。Safe等［10］进一步证实了LKB1基因突变所致的功能缺失，导致了促进肺癌新生血管形成的VEGF及其转录因子SP1表达水平的升高，从而促进了肿瘤的转移。Matsumoto等［11］研究发现LKB1突变产生的截短蛋白在肺癌组织阳性表达率为33%，且Ⅳ期肺癌组织中LKB1突变的阳性率明显高于Ⅰ期肺癌。Ghaffar等［12］对胰腺导管内乳头状黏液腺癌进行研究证实：胰腺癌中同样存在LKB1基因突变、丢失，其杂合性丢失率为32%，双等位基因失活率为9%，进一步研究发现LKB1基因早期突变、丢失易促进肿瘤形成，晚期丢失则促进恶性肿瘤的侵袭、转移。本研究中，LKB1在胃癌组织中的阳性率为20.9%，明显低于正常胃黏膜组织的95.0%（P＜0.01），且LKB1在胃癌组织中的表达程度与胃癌的TNM分期、淋巴结转移、Lauren's分型及预后有关（均P＜0.05）。由此，我们认为LKB1蛋白的缺失表达可能与胃癌的发生、发展及转移密切相关。

图1 LKB1及VEGF的表达与预后的关系

LKB1抑癌作用的机制可能与其负性调节VEGF有关［10］，LKB1能够下调VEGF的表达，对肿瘤新生血管产生抑制作用，从而达到抑制肿瘤发生发展的作用。VEGF是控制血管新生的信号因子，其正常调控在胚胎发育和低氧应激中有重要意义。研究表明，LKB1可以调节VEGF的水平。LKB1敲除的老鼠胚胎期即死亡，并伴随血管发育异常和VEGF表达量的明显上调，而且，过表达LKB1可下调VEGF的水平［13］。由于血管生成是实体瘤生长所必需的，上述调控关系说明了LKB1调节VEGF对抑制肿瘤生长的重要作用。研究发现，在LKB1与肺腺癌及乳腺癌发生的关系中，LKB1基因突变或缺失可造成胚胎血管发育异常，且能上调胚胎纤维母细胞中VEGF的表达，而VEGF过度表达提示正常组织癌变，这对肺癌及乳腺癌的诊断起重要的指导意义［14］。本研究所显示的胃癌组织中LKB1及VEGF表达的负相关（r＝－0.199，P＜0.05），提示LKB1蛋白可能通过下调胃癌组织中VEGF的表达，抑制胃癌新生血管产生，从而对胃癌细胞的发生发展起抑制作用。

综上所述，LKB1可能通过下调胃癌组织中VEGF的表达，抑制胃癌的发生、发展。LKB1基因的低表达可能是胃癌预后不良的重要危险因素。随着对LKB1的深入研究，为胃癌等恶性肿瘤的诊断和治疗提供新的科学依据，并有望为胃癌的基因治疗、肿瘤抑制剂的研发提供新的作用靶点。

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Clinical significance of the expression of LKB1 and vascular endothelial grow th factor in gastric cancinoma

HUANG Yue．Department of Pathology，Nanjing First Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210006，China；XIA Lei，MO Fu⁃gen，XU Xin⁃yu．Department of Pathology，Jiangsu Cancer Hospital，Nanjing 210009，China

ObjectiveTo investigate the expression of LKB1 and vascular endothelial growth factor（VEGF）in hu⁃man gastric cancer tissue and to investigate the clinical significance.M ethodsThe expressions of LKB1 and VEGF in 115 cases of gastric carcinoma and 20 cases of normalgastric tissueswere detected with immunohistochemistrymethod，and the relationship of the expression of LKB1 and VEGF with the clinicopathological parameters of gastric carcinoma was ana⁃lyzed.ResultsThe positive rate of LKB1 in gastric carcinoma and normal tissueswas 20.9%and 95.0%，respectively（P＜0.01）.The positive rate of VEGF in gastric carcinoma and normal tissues was 64.3%and 5.00%，respectively（P＜0.05）.The low expression of LBK1 was associated with tumor lymph node metastasis，stage，Lauren's classification and worse survival（P＜0.05）；The expression of VEGFwas associated with tumor lymph nodemetastasis，stage，distantmetas⁃tasis and worse survival（P＜0.05）.ConclusionsLow expression of LKB1 proteinmay play an important role in the de⁃velopment and progression of gastric cancer.LKB1may be used to assess themalignantbiological behavior and prognosis of gastric cancer.

gastric cancer；LKB1；vascular endothelial growth factor；immunohistochemistry

R 735.2

A

10.3969／j.issn.1003⁃9198.2014.09.009

2013⁃12⁃13）

江苏省自然科学基金项目（BK2012874）

210006江苏省南京市，南京医科大学附属南京医院病理科（黄悦）；210009江苏省南京市，江苏省肿瘤医院病理科（夏雷，莫伏根，徐新宇）

徐新宇，Email：redxxy＠163.com