TDZ在木本植物再生中的应用趋势及桑树中的前景

王旭炜 付杰 王青 陈鸿宇 曾其伟 何宁佳

（家蚕基因组生物学国家重点实验室，西南大学蚕学与系统生物学研究所，重庆 400716）

噻二唑苯基脲（N－phenyl－N－1，2，3－thiadiazol－5－ylurea，TDZ）是人工合成的苯基脲衍生物之一，微溶于水，易溶于DMSO（二甲基亚砜）和DMF（二甲基甲酰胺）。TDZ作为一种新型的植物生长调节剂，具有类似腺嘌呤类细胞分裂素的活性，最初被用作棉花脱叶剂[1]。TDZ不仅刺激腋芽，也能够刺激外植体形成愈伤、诱导器官形成和芽的再生，因此TDZ具有较强的刺激芽扩繁的能力，能够克服其他细胞分裂素遇到的扩繁难题。特别是TDZ浓度的变化能够有效影响外植体的发育形式，如杨树[2]、草莓[3]、巨尾桉[4]等。

桑树（Morus spp.）为多年生木本植物，桑叶是家蚕主要的天然饲料，具有较高的经济价值。近年来，桑树在石漠化、矿山修改、脆弱生态环境修复等生态治理中的功能也引起了越来越多的重视和关注[5－7]。桑树基因组测序的完成[8]，为研究桑树基因功能，阐明桑树耐逆境、富含活性次生物质等优势性状提供了良好的平台。众所周知，基于遗传再生体系的插入突变体技术[9]、超量表达[10]、RNAi干扰[11]以及最近热门的锌指核酸酶[12]、Talen[13]、Cas9[14]等基因编辑技术是研究基因功能最有利的工具，上述基因功能研究的方法都建立在成熟的转基因技术基础之上。虽然早在1990年就开始了桑树转基因探索[15]，在20世纪90年代也做了大量工作[16－19]，但是目前世界上有显著表型变化的桑树转基因研究报道数量极少[17，20－23]。究其原因，桑树不成熟的遗传再生体系可能是一个重要的因素，因此建立成熟、稳定的桑树遗传再生体系是进行桑树基因功能研究的重要基础和前提。

TDZ具有生长素和细胞分裂素的双重功能，许多难以再生的物种采用TDZ能达到高频分化。近年来，TDZ在许多物种的再生中得到了广泛的应用[24－27]，获得了重要的研究进展，本文在综述TDZ在再生体系功能的基础上，展望了TDZ在桑树再生体系的功能，为建立成熟稳定的桑树遗传再生体系奠定基础。

1 TDZ促进芽的形成

TDZ具有生长素和细胞分裂素的双重功能，能诱导许多植物外植体不定芽的形成（表1）。0.05mg/L的TDZ并添加其它激素培养四周后，能100%诱导坪山柚上胚轴产生不定芽，平均不定芽数为8.35个[24]。与CPPU相比，TDZ更有助于维持虎杖愈伤组织较好的生长活力，在适宜的分化培养基上能够迅速形成不定芽[25]。表1的结果表明，芽的再生主要用下胚轴、幼嫩叶片和子叶等外植体，在含有0.2～2μmol/L TDZ或者同时添加一定量的6BA和生长素类激素的培养基上诱导获得。

表1 芽的形成

2 TDZ诱导愈伤组织形成

在多种植物培养体系中添加TDZ都能诱导愈伤组织形成，且愈伤细胞增殖速率大大高于其他植物生长调节剂（表2）。TDZ诱导文冠果幼嫩叶片的愈伤组织产生于叶片的边缘及切口处，30d左右叶片全部形成愈伤组织[26]。在含TDZ培养基中，香椿的叶柄、茎段和叶片3种外植体均形成愈伤组织，愈伤组织的鲜重显著提高[28]。表2结果表明，0.1～1mg/L的TDZ能够有效的诱导植物外植体产生愈伤组织。随着浓度升高，TDZ依次诱导了叶柄、茎段和叶片等外植体都形成愈伤组织。外植体在愈伤组织诱导过程中吸收TDZ含量比其他植物生长调节剂低，因而有人认为培养的植物体内有相当高的内源TDZ活性物质[39－40]。

3 TDZ诱导体细胞胚胎发生

植物体细胞胚胎发生是植物再生的重要途径之一，也是植物发育早期阶段研究的有效研究模式。TDZ对大多数植物的体细胞胚胎发生有促进作用[39]，其中研究最多的是花生、兰花和天竺葵等植物如表3。TDZ对体细胞胚胎发生的促进作用可能与处理浓度和时间有关。体细胞胚胎发生和芽再生相比，所需的TDZ浓度相对较高，范围是10～30μmol/L。有报道认为，在植物体细胞胚胎发生过程中，TDZ能够调节内源植物激素或者相关的酶活性，或者通过胁迫诱导改变植物生理状态[39]。

表2 愈伤组织诱导

4 原生质体培养

在原生质体细胞壁形成初始阶段和细胞分裂期间，添加的TDZ（与生物素类物质NAA、2，4－D配合使用）浓度在0.001～20μmol/L能够完成原生质体愈伤组织的植株再生（表3）。草莓的原生质体培养过程中，TDZ能够有效地提高原生质体的存活能力同时也提高再生频率[45]。TDZ对诱导原生质体愈伤组织植株再生的作用似乎强于细胞分裂素类物质反应，但是这种效应的真正机理仍不清楚[39－40]。

表3 体细胞胚胎发生和原生质体培养

5 TDZ在桑树组织培养中的应用

TDZ在桑树组织培养中也得到了大量应用。在国内，TDZ可显著提高桑树叶片愈伤组织和再生芽的诱导率，通过优化愈伤组织诱导及不定芽分化条件，获得了93.9%的愈伤组织诱导率和100%的不定芽分化率[42，48－49]。桑树的冬芽在添加生长激素TDZ的培养基上也能较好地诱导和促进愈伤组织的形成与生长，但会抑制生长芽的再生长[50]。

国外对TDZ在桑树上的研究主要集中在诱导种子萌发、促进丛生芽、诱导愈伤组织或者直接诱导不定芽等方面。早在1994年就报道了TDZ诱导桑树叶片形成再生芽[51]。S.Bhatnagar等用不同浓度（1、2.5、5、10μmol/L）处理印度桑K2和DD的下胚轴、子叶和叶片，结果发现5μmol/L TDZ能够诱导下胚轴的不定芽再生能够达到50%，子叶的诱导率能够达到70%，而叶片在含有2.5μmol/L TDZ培养基培养30d后也能够生产出不定芽，同时也发现用来源于体外培养的腋芽上的7d的叶片外植体再生效率要好于来源于幼苗和大田的叶片[38]。TDZ也能够促进印度桑C176和C776的丛生芽生长[53]。来自14d胚的外植体被放置于添加了7μmol/L TDZ的培养基培养45d后，每个外植体能够得到20.3个再生芽，而在选用的3个品种发现，S－36的再生效率高于K2和S－1[37]，而S－36的愈伤组织在含有1μmol/L的TDZ培养基上，能够诱导形成最多数量的再生芽[37]。将无菌桑树苗的叶片先放置在含有18.17μmol/L TDZ培养基上8～10d，然后转移入含8.88μmol/L BA的MS培养基上不定芽诱导率达到77.6%～89.2%[53]。Umate等人发现，印度桑原生质体培养的微愈伤能够在TDZ 4.5μmol/L培养基上能够诱导形成完整的植株[32]。而印度桑品种V1的叶片，在添加TDZ 1.0mg/L培养基中能获得63%的丛生芽和68%再生率[54]。2008年和2011年，印度桑通过TDZ诱导产生的再生植株的转基因文献相继报道[20，26，55]，为研究者进一步研究桑树基因功能和遗传育种打开窗户，同时也为其他桑树的再生提供了参考。

6 讨论

研究表明TDZ对不定芽的诱导增殖和对愈伤组织的诱导具有显著的辅助作用[38，41，56－58]。细胞分裂素的活性研究表明，TDZ具有相当广泛的细胞分裂素活性，可能了刺激内源细胞分裂素的生物合成或改变内源细胞分裂素的代谢，从而导致天然细胞分裂素的增加[1，59]。此外，TDZ能刺激生长素的从头合成，如培养在TDZ培养基中的花生幼苗的吲哚基乙胺和色氨酸含量增加[59]。

TDZ处理花生幼苗，花生体内的矿质元素锰、铁、铜、钙、镁、钾和ATP、ADP、AMP积累[24，59－60]；TDZ处理后天竺葵根中的蛋白质、脱落酸和4－氨基丁酸等与胁迫相关的代谢物含量增加[60]。可见，TDZ诱导体细胞胚发生和再生可能是植物克服胁迫的外在表现。TDZ提高叶片外植体的再生效率还表现在其能保护叶片细胞膜结构的完整性，抑制脂质过氧化，抑制氧化物酶的活性，阻止叶片叶绿素的降解，延缓离体叶片的衰老[63]。

TDZ对不定芽的诱导增殖和对愈伤组织的诱导具有最适作用浓度，含量过低时效果不明显，浓度过高对愈伤组织及不定芽的生长表现出明显的毒害作用[28]。TDZ诱导芽再生的适宜浓度为0.01～2mg/L，高于此值则有利于愈伤组织和体细胞胚形成。0.01～0.1mg/L TDZ在含有低浓度的0.1～0.5mg/L BA和NAA的培养基中，能够直接诱导幼嫩叶片和下胚轴产生芽[24，40]；若缺乏BA，TDZ能够诱导芽形成的适宜浓度需提高到为0.5～2.0mg/L，其原因可能在于BA和TDZ能有效协同刺激芽的诱导。TDZ诱导愈伤组织的适宜浓度与诱导芽相近或者稍高的原因是，大多数植物芽的诱导可能先形成愈伤组织，进而植物感受到细胞外环境的胁迫，进一步诱导芽的形成。TDZ诱导体细胞胚和原生质体报道相对较少，单独添加高于2.0mg/L的TDZ就能够诱导体细胞胚的发生，原生质体培养的TDZ的适宜浓度为0.001～20μmol/L如（表3）。

TDZ同时具有细胞分裂素和生长素活性，能够直接诱导叶片、子叶和下胚轴形成再生芽，因而相较于其它细胞分裂素具有独特的优势。TDZ的这种再生优势在桑树组织培养中也得到较好应用，其最适的浓度为0.5～4mg/L[20－23]。当然，TDZ诱导桑树再生所需时间存在差异，子叶和下胚轴5～10d就能诱导出再生芽，而叶片需要30～40d[38]。此外，采用TDZ先诱导愈伤组织进而诱导芽则需要更长的时间才能获得再生，在此过程中还需要其它细胞分裂素及生长素的参与[42]。

TDZ诱导桑树再生除了时间上存在差异外，在组织来源上也存在差异，来源于腋芽的叶片的再生率高于直接来源于野外的叶片或幼苗叶片[38]。这是因为腋芽的叶片适应了组培环境，对TDZ引发胁迫的耐受性更高，使TDZ能够持续作用于叶片。外植体的成熟度也是影响再生的关键因素，扩繁后5～10d的桑树外植体（子叶和下胚轴）再生率要高于其他时间[38]。

由此可见，TDZ是诱导植物再生的有效激素，可应用于桑树再生体系的建立，前人所做的有益探索，为我们奠定了坚定的基础。以TDZ为主要激素源，桑树再生体系探索可以围绕以下几个方面进行：①建立高效的桑树无菌繁殖体系是基础；②筛选适合的桑树组织外植体；③根据再生途径筛选适宜的TDZ作用浓度；④混合使用其它细胞分裂素、生长素以及AgNO3等提高桑树再生频率。目前桑树学科已经进入基因组时代，高效稳定的遗传再生体系将是研究桑树基因功能最有效的方法，本文将为桑树再生体系的建立提供有益的借鉴。

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