四川省7个特色桑品种RAPD分析

李萤 刘玲 张佳钰 范小敏 陈祥平 柯皓天 沈曦彤 陈仁芳

（1.西南大学生物技术学院，重庆 400716；2.四川省丝绸工程技术研究中心，成都 610031）

桑树品种分子亲缘关系分析是桑树学科最基础研究，对桑树品种的保存、杂交育种亲本选择、分子辅助育种、品种资源开发利用均具有重要作用。其分析方法已见核糖体DNA内转录间隔区（internal transcribed spacers，ITS）标记[1－4]，也见于随机扩增片段长度多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）标记[4－18]。本文用RAPD方法对四川省桑树品种的7个特色亲缘关系进行了分析，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验材料取于四川省江油市蚕桑技术研究所桑品种园。为了鉴定7个特色桑树品种亲缘关系，参照董若铖等（2012）研究，选取浙江裂叶火桑、四川鬼桑、斯里兰卡桑、荥经川桑、湖北蒙桑、新疆黑桑、云南毛叶奶桑、金佛山华桑、重庆构树、广东荆桑、钦州长果桑、广西鸡桑、云南长穗桑、剑持、咸丰长穗桑、云南光叶桑、滇桑为评鉴系统（表1）。

1.2 DNA提取及质量检测

总DNA提取采用稍加改进的CTAB法[20]，从约0.15g的硅胶干燥桑叶中提取，质量和浓度用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计（赛默飞世尔科技公司））检测，并用1%琼脂糖凝胶电泳，λDNA/HindⅢmarker在紫外分光核酸测定仪（GENEQUANT，Eppendorf，Gemany）检测复核。

1.3 引物筛选

根据张有做等（1998）、赵卫国等（2000）、付大煦等（2005）、楼程富等（2002）的研究，用如下32个引物进行筛选。

表1 研究材料

先用一个DNA样品，对引物初选，再用4个样品DNA进行第二次筛选，选出多态性高的引物用于RAPD实验。

1.4 PCR扩增及产物检测

RAPD扩增反应在Gene Company Limited PCR仪上进行。反应总体积20μl，其中含模板（TEMPLATE）1μl（25ng/μl）、10×PCR buffer 2μl、引物2μl（50ng/μl）、Mg2＋2μl（2.5 mM）、dNTPs2μl（2.5mM）、Ex－taq 0.3μl（5U/μl），用ddH2O补至20μl，最后加矿物油0.3μl。扩增程序为95℃预变性4min；95℃变性45s；36℃退火45s；72℃延伸90s；38个循环，72℃延伸8min，反应结束控制在12℃。每次PCR反应均设不含模板DNA的空白对照。重复两次，确定所得条带的可重复性。

PCR反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压110V（4V/cm，稳压）电泳约20min，溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色5～10min，在BIO－RAD Gel DocTM EZ Imager 2000凝胶成像系统（美国伯乐）拍照记录。

1.5 数据分析

根据扩增条带的迁移率，同一迁移率的条带用引物名＋分子量命名，有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，形成数据矩阵，按Nei's等的方法[21]，输入Popgen32软件（版本PHYLIP3.5）计算遗传相似度genetic identity（I）与遗传距离Genetic distance（D），根据遗传距离用邻接法聚类分析。得到聚类图与ITS分支图比较。

2 研究结果

2.1 引物筛选及PCR扩增

32个引物第一次筛选，选出多态性高的17个引物。第二次复选，选出多态性高的9个引物进行RAPD实验。引物如下：

9个引物，对24个样品DNA进行扩增，共扩增出409条谱带，形成不同迁移率66条，平均每个引物扩增7.3条，片段大小在200～2 200bp，显示出丰富的多态性。图1为J－20号引物扩增结果。

图1 J－20号引物RAPD－PCR扩增结果

2.2 遗传一致度（I）与遗传距离（D）

将有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，形成数据矩阵，输入Popgen32软件（版本PHYLIP3.5）计算遗传一致度（I）和遗传距离（D），计算结果：盘桑2号与剑持遗传距离最近（0.248 9）；圌桑14与金佛山华桑遗传距离最近（0）；圌桑12号与广西鸡桑遗传距离最近（0.145 7）；圌桑11号与金佛山华桑遗传距离最近（0.052 2）；圌桑10号与浙江裂叶火桑、保康蒙桑遗传距离最近（0.248 9）；圌桑6号与圌桑14号遗传距离最近（0.206 3）；圌桑2号与圌桑10号遗传距离最近（0.466 6）（表2）。

表2 四川省几个特色桑树品种遗传一致性和遗传距离

2.3 聚类分析

基于Nei's（1979）遗传距离、RAPD资料、邻接法，UPGMA聚类，得聚类图。圌桑10号、盘桑2号与浙江裂叶火桑、四川鬼桑、剑持亲缘关系近；圌桑6号、圌桑12号、圌桑11号、圌桑14号与斯里兰卡桑、保康蒙桑、广西鸡桑、荥经川桑、金佛山华亲缘关系近；圌桑2号与广东荆桑亲缘关系近。聚类图首先将广东荆桑、圌桑2号分出，将其它材料聚为2大类。第一大类比较复杂：钦州长果桑单独分出；圌桑10号、盘桑2号、浙江裂叶火桑、四川鬼桑、剑持聚为一支，圌桑6号、圌桑12号、圌桑11号、圌桑14号、斯里兰卡桑、保康蒙桑、广西鸡桑、荥经川桑、金佛山华聚为一支，重庆构树与云南长穗桑被聚在第一大类二支之间；第二大类包括新疆黑桑、云南毛叶奶桑、咸丰长穗桑、云南光叶桑、云南滇桑（图1）。

3 讨论

3.1 RAPD资料聚类分析能将供试的桑树品种细分

基于RAPD聚类图，能很好地将供试的四川7个特色桑树品种分开。如圌桑10号、盘桑2号与浙江裂叶火桑、四川鬼桑、剑持聚在一起；圌桑6号、圌桑12号、圌桑11号、圌桑14号与斯里兰卡桑、保康蒙桑、广西鸡桑、荥经川桑、金佛山华聚在一起；圌桑2号与广东荆桑聚在一起。而基于ITS资料分支图，并没有将供试的品种完全分开。

图1 基于UPGMA 7个特色桑品种聚类图

3.2 RAPD资料适合种内亲缘关系分析，不适合种以上亲缘关系分析

RAPD资料属等位基因频率资料，适合种内水平亲缘关系的分析。在分析桑属种间或属间的亲缘关系时，由于不同种的扩增片段有时并不同源[22－24]，聚类分析结果与中国植物志桑属的分类相矛盾，难以解释。如本研究广东荆桑与圌桑2号首先分出；将钦州长果桑聚在第一大类，单独分出；将荥经川桑、金佛山华桑聚在第一大类，均反映了RAPD资料分析桑属种以上水平亲缘关系的缺陷。

3.3 RAPD资料无法设定外类群

随机扩增片段长度多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）技术由Willams和Welsh等先后于1990提出[25－26]。该技术是建立在DNA聚合链式反应（Polymerase Chain reaction，PCR）基础上，对未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。以单个人工随机合成的寡核苷酸为引物，以生物的基因组DNA为模板，在Taq酶的作用下，进行PCR扩增反应，用扩增产物不同长度来检测DNA的多态性。用该多态性反映基因组的多态性，进而分析亲缘关系。该方法无法假定外类群，只能将RAPD扩增片段转换成“0”“1”数据，用遗传相似性和遗传距离分析亲缘关系。例如本研究实验材料构树是作为外类群参与分析，由于无法设定外类群，在聚类图却聚在了第一大类两支之间，难以解释。

通过比较本研究聚类图与董若铖等，2012基于ITS分支图，两种资料各有长处，建议在分析桑属的系统学时，先用ITS资料进行初步分类，确定亲缘关系大致框架，再用RAPD资料对种下不同品种进行细分。

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